2010-2019 年北京市副溶血性弧菌临床分离株血清型和耐药性分析

曲梅 田祎 黄瑛 刘白薇 张新 吕冰 贾蕾 王全意

副溶血性弧菌(vibrio parahaemolyticus, VP)是沿海地区引起食物中毒和夏秋季腹泻的首要病原菌。副溶血弧菌血清型复杂多样。 目前,已知13 个O 抗原和79 个K 抗原[1],有71 种血清型可引起急性胃肠炎。 北京市虽为内陆城市,但近年来,由于饮食习惯和物流的发展,副溶血性血弧菌引起的腹泻也呈上升趋势。 由于抗生素的不规范使用和选择压力,细菌耐药问题也日益严重,许多副溶血性弧菌临床分离菌株出现多重耐药现象[2,3]。 北京市自2010 年以来,在全市二级以上医院肠道门诊开展腹泻病原学监测,为了解北京市副溶血性弧菌血清型变迁和流行特征,现将该市2010-2019 年副溶血性弧菌临床分离株进行血清型和耐药性分析。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 2010 年4 月-2019 年12 月,以北京市16 个辖区为监测点,每区每周采集10 份感染性腹泻病人新鲜粪便样本,全年每区最低监测量330 份,截止到2019 年12 月份,全市共收集46 249 份样本。所有样本进行副溶血性弧菌的分离、培养和鉴定。

1.2 方法

1.2.1 分离培养和生化鉴定: 分离培养参照《感染性腹泻诊断标准》(WS271-2007 )附录B.3 进行。 样本接种于10 mL 含3% NaCl 的碱性胨水中,37 ℃增菌培养6 h。 增菌液划线接种于科玛嘉弧菌显色琼脂平板,置37 ℃培养18 ～24 h。 挑取可疑菌落,采用VITEK2-Compact 全自动微生物鉴定系统(法国梅里埃公司)进行系统生化鉴定。

1.2.2 血清分型: 采用诊断血清(日本生研公司)进行分型。 取一定量细菌于3%NaCl 盐水中,121 ℃,处理30 min,离心10 min(4 000 r/min),弃上清。 取菌体,做O 抗原血清凝集试验。 K 抗原鉴定:直接取浓菌悬液与多价抗K 血清按适当比例混合,出现凝集反应时再用单个抗血清进行检测。 用生理盐水做对照。

1.2.3 药敏试验: (1)2010-2011 年菌株药敏试验采用纸片扩散法(Kirby-Bauer,kB)进行,药敏纸片及MH 培养基均为OXIOD 公司产品。 11 种药物及抑菌环直径(mm)判定标准:环丙沙星(CIP):耐药(R)≤15,敏感(S)≥21 mm;氨苄西林(AMP):R≤13,S≥17;氯霉素(CHL):R≤12,S≥18;磺胺异噁唑(SUL):R≤10,S≥16;萘啶酸(NAL):R≤13,S≥19;头孢唑林(CFZ):R≤14,S≥18;头孢噻肟(CTX):R≤14,S≥23;阿莫西林-克拉维甲酸(AUG):R≤13,S≥18;四环素(TET):R≤11,S≥15;亚胺培南(IMP):R≤13,S≥16;庆大霉 素(GEN):R ≤12,S ≥15。 (2)2012-2013 年菌株药敏试验采用梅里埃VITEK2-Compact 全自动微生物鉴定系统GN-13 药敏卡进行机器自动判读,增加了临床常用药:复方磺胺甲噁唑(SXT)、氨苄西林/舒巴坦(AMS)、头孢他定(CAZ)、头孢吡肟(FEP)、氨曲南(AZM)、阿米卡星(AMI)、左氧氟沙星(LEV);减少了阿莫西林-克拉维甲酸(AUG)、氯霉素(CHL)、磺胺异噁唑(SUL)、四环素(TET)等药物。(3)2014-2019 年菌株药敏试验采用最小抑菌浓度(minimal inhibition concentration,MIC)法,使用革兰氏阴性需氧菌药敏检测板(上海星佰生物技术有限公司)。 2014-2015 年使用的是单块板包括16 种药物,2016-2019 年使用的两块板包括28 种药物。 增加了链霉素(STR)、头孢西丁(FOX)、头孢曲松(CRO)、多西霉素(DOX)、阿奇霉素(AZI)、吉米沙星(GMI)、卡那霉素(KAN)、米诺环素(MIN)、多黏菌素E(CT)、多黏菌素 B (PB) 等。 药敏试验均以大肠埃希菌(ATCC25922)做为质控菌株。 对三种及以上抗生素耐药,既为多重耐药(multidrug resistance,MDR)。 由于试验方法的更新,药物种类也在不断调整,但所有研究结果都是以美国临床实验室标准化协会(clinical and laboratory standards institute,CLSI)2017 年标准进行比较判读,各试验方法间和不同年代数据结果都具有可比性,按每两年进行汇总统计。 (4)产超广谱β-内酰胺酶(Extended-Spectrum β-Lactamases,ESBLs)判定标准:在初筛实验(MIC 法)中头孢他啶或头孢噻肟MIC≥2 μg/mL;在ESBL 表型确证试验(MIC 法)中,对两组中任何一个药物,在加克拉维酸后MIC 值与不加克拉维酸的MIC 相比,降低值≤3 个倍比稀释浓度。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0 软件和WPS 2016专用版对数据进行统计处理。 计数资料以率表示,耐药率比较采用χ2检验。 P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 腹泻患者副溶血性弧菌分离情况 2010 年4 月-2019 年12 月收集肠道门诊腹泻患者粪便样本46 249件,共检出副溶血性弧菌1 853 株,检出率为4.0%(表1)。 其中20 ～39 岁青壮年组副溶血性弧菌检出率显著高于其他年龄组,差异具有统计学意义(P ＜0.01)。 副溶血性弧菌感染患者的男女性别比为1.2 ∶1(1 002/851)。

表1 2010-2019 年北京市腹泻患者不同年龄组副溶血性弧菌分离率、性别及主要血清型分布

表2 2010-2019 年北京市副溶血性弧菌血清型分布

续表2

表3 2010-2019 年北京市副溶血性弧菌的药敏结果

续表3

2.2 副溶血性弧菌血清分型 对1853 株副溶血性弧菌进行血清学分型,共检测出9 个O 群,30 个K 抗原,鉴定出59 种血清型(表2)。 K 抗原缺失即KUT菌株较为常见,除了O6 群外,见于各O 群菌株。 O3 ∶K6型为优势血清型1 254 株,占67.7%;O4 ∶KUT 型164 株,占8.9%;O4 ∶K8型113 株,占6.1%,位居血清型的第3 位。 前4 ～10 位血清型依次是O1 ∶KUT、O2 ∶K3、O4 ∶K9、O3 ∶KUT、O10 ∶K60、O1 ∶K36 和O4 ∶K6。其余血清型菌株数均不超过10 株。

不同年份血清型构成和分布随着年代的更迭会发生变迁。 2010 年位居第二位的血清型为O4 ∶K9,2011-2012 年则主要是O4 ∶K8,而近些年又逐步被O4 ∶KUT 所赶超。有很多新的血清型出现:如O10 ∶K60自2013 年首次出现,连续几年持续存在;罕见血清型O1 ∶K1,O3 ∶K30 为2019 年 新 出 现 血 清 型;另 外 每 年都会出现1 ～5 种仅检出1 株的一过性血清型。

2.3 耐药表型特征苄西林的耐药率虽然较其他药物处于较高水平,但呈现波动式下降:从2010-2011 年的96.8%到2014-2015 年的24.5%到2018-2019 年的17.1%,随之相对应的是敏感率有上升的趋势(表3)。 链霉素、阿莫西林-克拉维酸和磺胺异噁唑三种药的耐药率在2014-2015 年出现了异常的升高,分别为46.5%、30.2%和22.0%,之后有一个下降,随后趋于平稳上升。 其他各类药物虽然会出现不同年间的波动,但伴随着敏感率的逐渐降低,耐药率总体呈现逐渐增高趋势。

2.3.3 多重耐药及ESBLs: 对于耐三种以上抗生素的多重耐药菌株,随着年代的增加,检测的抗生素种类增多,也呈上升趋势,从2010 年的三重耐药菌株9株(3.6%);到2014 年出现耐3 种以上抗生素达到32株(20.1%);甚至2018 年以后出现最多抗16 种抗生素的多耐药菌株,各抗生素排列组合后有几十种模式。 另外,2016 年以后出现了产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)菌株5 株。

2.3.1 药敏概况: 对1 428 株副溶血性弧菌进行耐药性检测,总体情况:对氨苄西林和多黏菌素E 耐药率最高,分别为51.5%和47.8%,敏感率分别为33.2%和52.2%(表3)。 其次对头孢唑林和链霉素的耐药率为22.9%和10.5%。 对头孢西丁、头孢噻肟和头孢吡肟等二、三、四代头孢会出现个别菌株的耐药,但敏感率均达到99%以上。 对环丙沙星、左氧氟沙星和美洛培南无耐药。 对其他各类抗生素的代表性药,均有少量菌株耐药。

2.3.2 耐药率随时间变化: 2010-2019 年菌株对氨

3 讨论

血清型构成变化能反映种群的变迁,进而在一定程度上反映传染源的变异。 既往研究缺少对北京市年度跨越大,系统全面的副溶血性弧菌血清型报道。本研究提供了北京市从2010-2019 年较为年完整的人源副溶血性弧菌血清型分布谱。 位于前7 位血清型分别为O3 ∶K6、O4 ∶KUT、O4 ∶K8、O1 ∶KUT、O2 ∶K3、O4 ∶K9和O3 ∶KUT,除O3 ∶K6外,与上海市、温州市和我国东南地区人源菌株优势血清构成还是有差异的[4],上海 以O3 ∶K6、O4 ∶K8、O1 ∶K25、O4 ∶K68、O4 ∶K9、O1 ∶K36 和O3 ∶K29 为主[5],温州则以O3 ∶K6、O1 ∶K1和O4 ∶K1为主[6],与食源性菌株血清型差异性更大。前3 位优势血清型中,均以20 ～39 岁年龄组所占比例最高。 这与青壮年做为社会主要生产力,外出就餐机会多、接触病原体机会多有关[7,8]。 因此,应加强重点人群的监测,加强食品安全和公共卫生监管。

O3 ∶K6 血清型自1996 年被指定为大流行株,其他血清型 如O4 ∶K68、O1 ∶K25、O1 ∶KUT 和O6 ∶K18等,被认为是从O3 ∶K6大流行株演变而来并在亚洲和欧美等国家蔓延[9,10]。 本研究也在不同年份检出这些血清型,说明这些流行血清型在北京也有散在传播,造成人群感染。 另外,O4 ∶KUT 血清型近年呈明显上升趋势,国内有些地区已超过O3 ∶K6成为优势血清型[11]。 O10 ∶K60 做 为 一 种 新 的 血 清 型,2013 年 首 次从日本的急性胃肠炎患者中分离得到,它的毒力基因、分子特征与大流行菌株高度一致[12],而本研究O10 ∶K60 菌株也分离自2013 年,之后每年都在人群中有散发,这种血清型的来源和传播链还有待于从分子水平通过系统的基因组溯源研究来阐明。

通过本研究为期十年的耐药监测,发现副溶血性弧菌耐药性有上升趋势。 对氨苄西林和多黏菌素E耐药最严重,氨苄西林与多数研究结果一致[3,13],多黏菌素E 则未见报道。 对氨基糖苷类的链霉素存在一定程度的耐药,卡那霉素则无耐药,但其他文献报道,水产品中分离到的副溶血性弧菌对卡那霉素和链霉素耐药率都很高[13]。 本研究显示对环丙沙星的敏感率高达99%以上,与其他地区报道的低敏感率、高耐药率不同[13]。 2009-2013 年,我国东南沿海地区腹泻患者分离株耐药率普遍高,氨苄西林的耐药率最高为87.1%,其次是头孢西丁(56.9%) 和头孢唑林(43.7%)且多重耐药率高达28%[4],高于本次调查结果,亦明显高于2007-2009 年来自四川、辽宁、浙江、广西等地腹泻患者分离的副溶血弧菌耐药率[14]。 与血清型分布一样,不同的研究结果存在异质性,除受菌株分离年代、不同来源背景及采取控制干预措施后会引起血清型和耐药率的波动性变化等因素的影响,也说明在不同地区感染性腹泻患者中,副溶血性弧菌型别和对抗生素的敏感程度有地域差异。 另外副溶血性弧菌人源分离株中有ESBLs 菌株,暗示质粒等可移动遗传元件介导的耐药基因的传播及扩散,尤其是对氨苄西林抗性的影响,加速了多重耐药菌株的出现。 对腹泻患者采用抗生素药物治疗时,要充分考虑其不同区域之间存在的差异,结合药敏试验结果,确保临床合理用药,以降低耐药菌株的产生。