水杨酸浸种处理对藏药甘青青兰种子萌发及幼苗抗旱性的影响

禄亚洲，李 宁，张二豪2,，尹 秀2,，赵垦田，兰小中2,

(1.西藏农牧学院 高原生态研究所，西藏 林芝 860000；2.西藏农牧学院-西南大学药用植物联合研发中心，西藏 林芝 860000；3.西藏农牧学院 食品科学学院，西藏 林芝 860000；4.西藏农牧学院 资源与环境学院，西藏 林芝 860000)

多年生草本藏药甘青青兰(DracocephalumtanguticumMaxim.)是唇形科(Labiatae)青兰属(Dracocephalum)植物，别称为则羊古或唐古特青兰，主要分布在甘肃、青海、西藏及四川等地区[1-4]，生长在丛林林缘、山野路旁、高山草地、草滩、干燥河谷两岸等海拔为1 999～4 600 m的地方[5]，具有热胃清肝、祛湿清热、解表疏风、和胃舒肝和止血等功效[6-7]。

随着全球环境变化，干旱问题日益突出[8]，成为限制植物生长发育的主要因素之一[9-10]。干旱不仅导致植物叶片水势下降、气孔关闭、光合速率降低，严重时会导致机体因缺水而死亡[11]。因此，提高植物抗旱能力对农业生产有着重要意义。

植物体内内源激素水杨酸(Salicylic acid，SA)能够促进植物体内一系列抗性防御反应[12]。研究表明，在逆境条件下适宜浓度的SA溶液处理能提高植物的抗逆能力且能提升植物种子的萌发特性[13-17]，减缓植物机体内可溶性蛋白含量的下降速度，使植物叶片中叶绿素和可溶性糖含量增加，抗氧化系统的酶活性增强，水分利用率提高[18-21]。目前，有关SA浸种对藏药甘青青兰种子萌发及幼苗抗旱性的影响研究尚未见报道，鉴于此，研究不同浓度SA浸种对甘青青兰种子萌发特性的影响，待幼苗长至两叶期以PEG-6000作为干旱胁迫的渗透剂，对甘青青兰幼苗期进行模拟干旱胁迫处理，并研究适宜浓度SA浸种对干旱胁迫下甘青青兰幼苗抗旱能力的影响，以期获得能够提高甘青青兰种子萌发率和幼苗抗旱能力的最佳SA浓度，为藏药甘青青兰的人工栽培提供相应的参考依据。

1 材料和方法

1.1 材料

以西藏农牧学院藏药材种质资源圃繁育的甘青青兰种子为试验材料，选取颗粒饱满的种子，用0.5%次氯酸钠溶液消毒2 min，然后用无菌水冲洗数次，风干备用。

1.2 方法

1.2.1 SA浸种对甘青青兰种子萌发的影响试验

1.2.1.1 SA浸种处理 挑选50粒经消毒处理的甘青青兰种子，设置SA浓度为0(蒸馏水处理，CK)、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L，每个浓度处理设置3次重复。用上述5种浓度SA溶液对甘青青兰种子浸种24 h，弃去SA溶液，用蒸馏水冲洗3～5次，待种子晾干后置于铺有湿润滤纸的培养皿中，于光照培养箱中培养，光照强度为2 000 lx，光周期为16 h/8 h，日间温度为20 ℃，夜间温度为15 ℃。每天于同一时间段向培养皿中添加定量的蒸馏水，以便保持滤纸的润湿程度不变。

1.2.1.2 测定项目及方法 从培养当天开始，每隔1 d记录每个培养皿中种子的萌发数，待种子萌发率保持不变，萌发进程结束。种子的发芽率、发芽势、活力指数与发芽指数测定方法见参考文献[22-24]。

1.2.2 SA浸种对甘青青兰幼苗抗旱性的影响试验

1.2.2.1 PEG-6000水分胁迫处理 经1.2.1数据分析筛选出有助于甘青青兰种子萌发的SA最佳浸种浓度，用最佳浓度SA浸泡甘青青兰种子24 h，同时以蒸馏水处理作对照(CK)，在甘青青兰幼苗长势基本一致且长至2片完全叶时用20% PEG-6000溶液模拟干旱胁迫，3次重复。

1.2.2.2 测定指标及方法 在干旱胁迫第0、1、2、3 天分别测定甘青青兰叶片丙二醛、游离脯氨酸、可溶性蛋白、叶绿素含量。丙二醛含量采用硫代巴比妥酸显色法测定[25]；游离脯氨酸含量采用磺基SA法测定[26]；可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250染色法测定[27]；叶绿素含量采用乙醇提取比色法测定[28]。

1.3 数据处理与分析

采用Excel 2003软件处理数据，采用SPSS 17.0软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 SA浸种对甘青青兰种子萌发的影响

2.1.1 萌发进程 由图1可见，培养第3天,不同处理甘青青兰种子均开始萌发，其中不同浓度SA浸种处理萌发缓慢，随着萌发时间延长，CK和不同浓度SA浸种处理种子发芽率迅速增加，且萌发后期SA浸种处理种子发芽率高于CK，培养第15天甘青青兰种子萌发进程结束，发芽率达到最大值。SA浸种处理中0.6 mmol/L SA浸种24 h，萌发第15天时，甘青青兰种子发芽率最大，为54.44%，显著高于CK(发芽率为40.38%)。

不同小写字母表示同一时间差异显著(P<0.05The different small letters within the same time mean significant difference(P<0.05图1 不同浓度SA浸种甘青青兰种子的萌发进程Fig.1 The germination process of Dracocephalum tanguticum Maxim.seeds soaked by different concentrations of SA

2.1.2 萌发特性 由表1可见，适宜浓度SA溶液浸种均可以提高甘青青兰种子的发芽率，但增加幅度各不相同。0.6 mmol/L SA浸种24 h，甘青青兰种子的发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数均高于其他浓度SA浸种处理和CK，其中，较CK分别显著提高34.82%、34.42%、34.87%和54.86%。因此，在甘青青兰种子萌发时建议采用0.6 mmol/L SA浸种24 h的方法处理种子。

2.2 SA浸种对甘青青兰幼苗抗旱性的影响

2.2.1 丙二醛含量 丙二醛含量可以间接反映干旱胁迫对植物造成的伤害程度。由图2可见，随干旱胁迫时间的增加，0.6 mmol/L SA溶液浸种处理和CK甘青青兰幼苗丙二醛含量增多。相同胁迫时间，0.6 mmol/L SA溶液浸种处理甘青青兰幼苗的丙二醛含量显著低于CK。干旱胁迫第3天，CK甘青青兰幼苗丙二醛含量是0.6 mmol/L SA溶液浸种处理的1.11倍，0.6 mmol/L SA浸种处理可以减少丙二醛的累积，增强幼苗抗旱能力。

表1 不同浓度SA浸种处理甘青青兰种子的萌发情况Tab.1 The germination of Dracocephalum tanguticum Maxim.seeds soaked by different concentrations of SA

注：同列不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。
Note:The different small letters within the same column mean significant difference(P<0.05).

图2 0.6 mmol/L SA浸种对干旱胁迫条件下甘青青兰幼苗丙二醛含量的影响Fig.2 Effects of 0.6 mmol/L SA soaking seeds on the MDA content of Dracocephalum tanguticum Maxim.seedlings under drought stress

2.2.2 游离脯氨酸含量 由图3可见，随着干旱胁迫时间的延长，CK植株中游离脯氨酸含量呈先增高后降低的趋势，0.6 mmol/L SA溶液浸种处理植株游离脯氨酸含量呈上升趋势。0.6 mmol/L SA浸种处理甘青青兰幼苗游离脯氨酸含量显著高于CK。干旱胁迫第3天，SA溶液浸种处理植株体内游离脯氨酸含量是CK的3.25倍，说明SA浸种处理可以促进游离脯氨酸在植物体中的累积，从而提高植株的抗旱能力。

图3 0.6 mmol/L SA浸种对干旱胁迫下甘青青兰幼苗游离脯氨酸含量的影响Fig.3 Effects of 0.6 mmol/L SA soaking seeds on free proline content of Dracocephalum tanguticum Maxim.seedlings under drought stress

2.2.3 可溶性蛋白含量 由图4可以看出，随干旱胁迫时间延长，CK和0.6 mmol/L SA浸种处理的植株中可溶性蛋白含量均呈下降趋势。干旱胁迫过程中，CK和0.6 mmol/L SA浸种处理甘青青兰幼苗中可溶性蛋白含量无显著差异，表明 SA浸种处理对甘青青兰幼苗的可溶性蛋白含量无明显影响。

2.2.4 叶绿素含量 由图5可见，0.6 mmol/L SA浸种处理对甘青青兰幼苗叶片叶绿素含量产生一定程度的影响。随干旱胁迫时间延长，0.6 mmol/L SA浸种处理和CK叶绿素a和叶绿素b含量均呈下降趋势，叶绿素a/b逐渐增大，干旱胁迫第3天，0.6 mmol/L SA浸种处理与CK的叶绿素a、b含量及叶绿素a/b无显著差异，表明 SA浸种处理对甘青青兰幼苗的叶绿素含量无明显影响。0.6 mmol/L SA浸种处理和CK幼苗叶片中叶绿素a和叶绿素b含量以及叶绿素a/b的变化规律一致。

图4 0.6 mmol/L SA浸种对干旱胁迫下甘青青兰幼苗可溶性蛋白含量的影响Fig.4 Effects of 0.6 mmol/L SA soaking seeds on soluble protein content of Dracocephalum tanguticum Maxim.seedlings under drought stress

图5 0.6 mmol/L SA浸种对干旱胁迫下甘青青兰幼苗叶绿素a、b含量和叶绿素a/b的影响Fig.5 Effects of 0.6 mmol/L SA soaking seeds on chlorophyll a,b content and a/b in Dracocephalum tanguticum Maxim.seedlings under drought stress

3 结论与讨论

植物在逆境下，膜脂往往会发生过氧化作用，其分解产物丙二醛的含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度[29]。本研究中，随干旱胁迫时间的延长，0.6 mmol/L SA浸种处理和CK(未经SA浸种处理)甘青青兰幼苗中丙二醛含量均逐渐升高，但SA浸种处理幼苗中丙二醛含量低于CK。可能是SA浸种处理减少了干旱胁迫下丙二醛的积累，阻止交联反应产生，缓解膜脂过氧化作用，进而减轻干旱胁迫对甘青青兰幼苗的伤害。

大量研究表明，逆境条件下植物体内游离脯氨酸含量增加，脯氨酸积累有利于提高细胞渗透势，增强缺水时细胞膜结构的稳定性，从而减轻逆境对细胞的损害作用[30]。本研究中，干旱胁迫下，0.6 mmol/L SA浸种处理甘青青兰幼苗中游离脯氨酸含量高于CK，减轻了干旱对叶片细胞的伤害作用。

在逆境胁迫下，植物体内可溶性蛋白含量提高，是其适应逆境胁迫的一种应答反应，因此，可溶性蛋白含量可作为检测植物抗逆能力的一个指标[31]。一般认为，可溶性蛋白含量随胁迫时间延长相应升高，但也有研究表明，水分胁迫下可溶性蛋白含量呈下降趋势[32]。本研究中，0.6 mmol/L SA浸种处理和CK甘青青兰幼苗中可溶性蛋白含量随干旱胁迫时间延长表现为下降趋势，且二者差异不明显，表明甘青青兰的抗旱能力相对较弱。

叶绿素在光合反应中起着重要作用，主要参与光能的吸收、传递和转化[33]。水分胁迫会造成植物叶绿素含量降低，故叶绿素含量变化是植物遭受伤害程度的一种反映[34]，叶绿素a/b增大，可能是植物对逆境的一种防御性反应[35]。本研究中，随干旱胁迫时间延长，0.6 mmol/L SA浸种处理和CK甘青青兰幼苗中叶绿素a/b比值均呈上升趋势，表明甘青青兰可以通过调节体内叶绿素含量来抵御干旱胁迫对自身的伤害。

在本试验中，0.6 mmol/L SA浸种24 h甘青青兰种子的发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数最高，说明适宜浓度SA浸种可以促进甘青青兰种子萌发，0.6 mmol/L为甘青青兰的最佳SA浸种浓度。干旱胁迫下0.6 mmol/L SA浸种和CK甘青青兰幼苗中可溶性蛋白含量均呈下降趋势，叶绿素a/b均呈上升趋势，表明甘青青兰为一种抗旱能力比较弱的植物；0.6 mmol/L SA浸种24 h甘青青兰幼苗的丙二醛含量低于CK，游离脯氨酸含量高于CK，说明0.6 mmol/L SA浸种24 h可以提升甘青青兰幼苗的抗旱能力。