嘉宝果果皮提取物体外降糖活性研究

林宝妹 洪佳敏 邱珊莲 郑开斌 张帅 张少平 郑菲艳

摘要：【目的】研究嘉宝果果皮提取物的体外降糖活性，为嘉宝果果皮中降血糖成分的开发和利用提供参考依据。【方法】以阿卡波糖为对照，采用分光光度法测定嘉宝果果皮粗提物及其不同极性部位对α-葡萄糖苷酶和猪胰α-淀粉酶的抑制活性，并通过Lineweaver-Burk双倒数法分析各提取物的酶促动力学。【结果】果皮粗提物及其正丁醇部位、乙酸乙酯部位和水部位对α-葡萄糖苷酶的半数抑制浓度（IC50）分别为0.005、0.029、0.020和0.242 mg/mL，均远低于阿卡波糖（IC50=11.201 mg/mL）;Lineweaver-Burk双倒数作图显示，果皮粗提物及其正丁醇部位和乙酸乙酯部位对α-葡萄糖苷酶的抑制作用类型均为混合型抑制，水部位为竞争性抑制，阿卡波糖为非竞争性抑制。果皮粗提物及其正丁醇部位、乙酸乙酯部位和水部位对猪胰α-淀粉酶的IC50分别为0.242、0.686、1.426和33.315 mg/mL，均高于阿卡波糖（IC50=0.184 mg/mL）;Lineweaver-Burk双倒数作图显示，果皮粗提物对猪胰α-淀粉酶的抑制作用类型为反竞争性抑制，阿卡波糖为混合型抑制。【结论】嘉宝果果皮粗提物及其各极性部位对α-葡萄糖苷酶的抑制活性均高于阿卡波糖，对猪胰α-淀粉酶的抑制活性均低于阿卡波糖，可在一定程度上选择性抑制α-葡萄糖苷酶，具有减少胃肠道不良反应的潜力，可用于天然降糖功能因子的开发。

关键词： 嘉宝果果皮;极性部位;α-葡萄糖苷酶;α-淀粉酶

中图分类号： S667.9                          文獻标志码： A 文章编号：2095-1191（2020）02-0376-09

In vitro studies on the hypoglycemic effect of

jaboticaba peel extract

LIN Bao-mei， HONG Jia-min， QIU Shan-lian*， ZHENG Kai-bin， ZHANG Shuai，

ZHANG Shao-ping， ZHENG Fei-yan

（Institute of Subtropical Agriculture， Fujian Academy of Agricultural Sciences，  Zhangzhou， Fujian  363005， China）

Abstract：【Objective】In order to provide a theoretical basis for the development and utilization of hypoglycemic components in jaboticaba peel， the hypoglycemic activity of the extract of jaboticaba peel was investigated in vitro. 【Method】With acarbose for the control group，the inhibitory effects on α-glucosidase and porcine pancreatic α-amylase of the crude peel extract and its different polarity fractions were tested by spectrophotometric method. Meanwhile the enzymatic kinetics of each part was analyzed by Lineweaver-Burk plot. 【Result】The results showed that the median inhibitory concentration（IC50） value of α-glucosidase of crude peel extract， n-butanol fraction， ethyl acetate fraction and water fraction were 0.005， 0.029， 0.020 and 0.242 mg/mL， respectively，which were far below the acarbose（IC50=11.201 mg/mL）. Lineweaver-Burk plot showed that the inhibitory pattern of crude peel extract， n-butanol fraction and ethyl acetate fraction on the activity of α-glucosidase were mixed inhibition， competitive inhibition in water fraction and non-competitive inhibition in acarbose. The IC50 value of crude peel extract and n-butanol fraction， ethyl acetate fraction and water fraction on porcine pancreaticα-amylase were 0.242， 0.686， 1.426 and 33.315 mg/mL， respectively， which were all above the acarbose（IC50=0.184 mg/mL）. According to the Lineweaver-Burk plot， the inhibitory effect of crude peel extract on porcine pancreatic α-amylase was anticompetitive and that of acarbose was mixed inhibition. 【Conclusion】In summary， the jaboticaba peel extract and the different polarity fractions have higher inhibitory activity on α-glucosidase than acarbose， butthe inhibitory activity on porcine pancreatic α-amylase is lower than that of acarbose. Jaboticaba peel extract can selectively inhibit α-glucosidase， which has the potential to reduce adverse reactions in the gastrointestinal tract and can be used as a natural hypoglycemic functional component.

Key words： jaboticaba peel; polarity fractions; α-glucosidase; α-amylase

Foundation item： Fujian Public Welfare Research Institutes Special Project（2018R1024-6，2019R1030-4）;Youth Innovation Group Project of Fujian Academy of Agricultural Sciences（STIT2017-3-4）;Science and Technology Innovation Project of Fujian Academy of Agricultural Sciences（PC2018-9）

0 引言

【研究意義】从植物中寻找高效、低毒或无毒的降血糖活性成分一直是国内外研究的重点，也是药物研发的重要手段。植物多酚广泛存在于水果、蔬菜、谷物等植物的根、茎、叶、果皮和种子等部位，可通过影响肠道消化酶类活性达到调节血糖的目的（陈天晴，2018）。嘉宝果（Myrciaria cauliflora Berg）是桃金娘科（Myrtaceae）拟爱神木属（Myrciaria）果树，果皮富含多种多酚类化合物[花青素（矢车菊素-3-葡萄糖苷和飞燕草素-3-葡萄糖苷）、没食子单宁、黄酮醇、鞣花酸及其衍生物等]（Lima et al.，2011;Plaza et al.，2016），具有抗氧化（Araújo et al.，2013）、抗肿瘤（Wang et al.，2014）、抗炎（Machado et al.，2018）和降血脂（Quatrin et al.，2018）等多种药理学功效。若能从嘉宝果果皮中筛选出具有降血糖活性的有效成分，对糖尿病治疗药物的研发及嘉宝果果树资源的多元化开发和利用均具有重要意义。【前人研究进展】目前，国内对嘉宝果的研究主要集中在栽培技术及观察引种表现方面（黄丽蓉，2015;梁海峰等，2017;只佳增等，2018），而国外学者对嘉宝果的研究多为药理学功效。Hsu等（2016）通过小鼠体内实验证实，嘉宝果果皮具有改善糖尿病的作用，不仅能减少肾脏组织中炎性细胞因子如IL-1β、IL-6和TNF-α等炎症介质的释放，减轻炎症反应，还可通过提高抗氧化酶（超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶）活性及清除过多的活性氧，降低体内氧化应激水平。Lamas等（2018）将嘉宝果果皮提取液每日灌胃处理高脂饲养小鼠，60 d后发现，果皮提取液不仅可降低空腹血糖，提高组织对胰岛素的敏感性，还能提高HDL-C水平，改善脂质代谢。Quatrin等（2018）将不同剂量的嘉宝果果皮冻干粉直接添加至糖尿病大鼠饮水中，连续喂养8周，结果发现，与高血糖组相比，高剂量组（10.8 g/L）大鼠血糖降低19%，血清中炎症因子TNF-α的水平及转氨酶活性均降低，肝脏肥大情况改善，证明嘉宝果果皮具有一定的保肝功能;此外，嘉宝果果皮各剂量组均可减少大鼠血浆中TG、TC、LDL-C和VLDL-C含量，但对HDL-C含量影响较小。本课题组前期也开展了嘉宝果根、茎、叶、果皮等部位的抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制作用研究，结果发现，嘉宝果果皮是DPPH·、ABTS+和·OH等自由基的有效清除剂，并可剂量依赖性抑制α-葡萄糖苷酶活性，对该酶的抑制作用远超常见的α-葡萄糖苷酶抑制剂——阿卡波糖（邱珊莲等，2018）。【本研究切入点】嘉宝果果皮具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性，但有关果皮提取物对α-淀粉酶的抑制作用和降血糖组分筛选研究尚未见报道。【拟解决的关键问题】采用不同极性的有机溶剂对嘉宝果果皮粗提物进行梯度萃取，并测定其体外抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的能力及抑制作用方式，为嘉宝果果皮的开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试嘉宝果品种为沙巴，成熟果实采自福建省农业科学院亚热带农业研究所。主要试剂：α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase，G5003-100UN）、4-硝基苯-α-d-吡喃葡萄糖苷（PNPG，N1377-1G）和猪胰α-淀粉酶（V900486-100G）购自美国Sigma公司;阿卡波糖水合物（Acarbose hydrate，C25H43NO18·xH2O，A2485）购自日本东京化成工业株式会社，纯度>98%;淀粉、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、碳酸钠、乙醇、正丁醇和乙酸乙酯均购自国药集团化学试剂有限公司，为分析纯。主要仪器设备：紫外可见分光光度计（L5S型，上海仪电分析仪器有限公司）、超纯水机（UPW-20N型，北京历元电子仪器有限公司）、分析天平（BS110S型，德国Sartorius集团）、粉碎机（WBL2521H型，佛山美的集团）、数控超声波清洗仪（KQ-300DE，昆山市超声仪器有限公司）、冷冻高速离心机（MIKRO-22R，德国Hettich公司）、台式冷冻恒温振荡仪（THZ-C-1，苏州培英实验设备有限公司）、旋转蒸发仪（RE-52AA，上海亚荣生化仪器厂）和酶标仪（iMARK，美国Bio-Rad）。

1. 2 嘉宝果果皮提取物不同极性部位制备

1. 2. 1 果皮粗提物制备 嘉宝果成熟果实除去果籽和果肉得到果皮，将果皮置于热风干燥箱内60 ℃烘干至恒重后，于粉碎机中粉碎（28000 r/min）1 min，过40目筛;以70%乙醇为提取溶剂，取适量果皮粉末按料液比1∶60（g/mL）混匀后于28 ℃恒温振荡箱中180 r/min振荡提取20 h，之后再置于超声波清洗仪中（28 ℃、功率120 W）提取20 min，获得嘉宝果果皮粗提物，将其于冷冻离心机中8000 r/min离心15 min，取上清液待用。

1. 2. 2 不同极性部位制备 取1.2.1中获得的果皮粗提物旋转蒸发至无醇味，得到粗提物浓缩液，以超纯水稀释浓缩液至原提取液体积，按照体积比1∶1，依次以乙酸乙酯和正丁醇萃取3次，合并萃取液，采用旋转蒸发法除去各萃取液溶剂，以超纯水或30%乙醇重新溶解浓缩液获得果皮粗提物的乙酸乙酯部位、正丁醇部位及萃取后剩下的水部位，以每毫升提取液所含有的原材料质量表示各极性部位质量浓度，单位为mg/mL。

1. 3 α-葡萄糖苷酶活性抑制率测定

参照Sichaem等（2017）的方法，并稍作修改，具体如下：采用0.05 mmol/L PBS缓冲液（pH 6.8）配制0.8 U/mL的a-葡萄糖苷酶，0.2 mmol/L PBS缓冲液（pH 6.8）配制5.0 mmol/L PNPG。在96孔板中先加入10 μL嘉宝果果皮提取物或阿卡波糖样品和10 μL a-葡萄糖苷酶，混匀后于37 ℃温箱中孵育10 min，然后加入50 μL PNPG继续孵育20 min，最后加入100 μL 0.2 mol/L碳酸钠终止反应，在酶标仪上测定其在405 nm波长处的吸光值A1，同时设置空白对照组A0（以超纯水代替样品）、空白溶剂对照组A2（以超纯水代替样品和反应试剂）和样品本底组A3（以超纯水代替反应试剂）。根据公式（1）计算a-葡萄糖苷酶活性抑制率，并计算酶活性被抑制50%时的抑制剂浓度，即半数抑制浓度（IC50）。同时，按照上述方法测定阿卡波糖质量浓度为5～30 mg/mL时对a-葡萄糖苷酶的抑制率。

酶活性抑制率（%）=[A0-（A1-A3）]/（A0-A2）×

100  （1）

1. 4 α-葡萄糖苷酶酶促动力学分析

固定α-葡萄糖苷酶浓度（0.8 U/mL）不变，选用不同浓度（0.05、0.10、0.20、0.30和0.40 mmol/L）的PNPG为底物[S]，以阿卡波糖为对照，在阿卡波糖质量浓度分别为1.000和2.000 mg/mL、嘉宝果果皮粗提物质量浓度分别为0.002和0.004 mg/mL、乙酸乙酯部位质量浓度分别为0.010和0.020 mg/mL、正丁醇部位质量浓度分别为0.030和0.040 mg/mL、水部位质量浓度分别为0.050和0.100 mg/mL的条件下，测定α-葡萄糖苷酶酶促反应速率（V），平行测定3次，同时设空白对照组，以超纯水（0 mg/mL）代替阿卡波糖或嘉宝果果皮提取物，通过Lineweaver-Burk双倒数法，以1/V-1/[S]作图，对二者进行线性拟合，并按米氏双倒数方程[公式（2）]计算最大酶促反应速率（Vmax）和米氏常数（Km）。可根据直线相交情况和Vmax、Km的变化情况判断酶抑制作用类型，酶抑制剂对酶的可逆抑制作用包括竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制。若得到一组相交于Y轴的直线，Vmax不变，Km增大，则为竞争性抑制;若得到一组相交于X轴的直线，Vmax减小，Km不变，则为非竞争性抑制;若得到一组平行的直线，Vmax和Km均减小，则为反竞争性抑制（杨荣武，2012）。

[1V] = [KmVmax]×[1[S]]+[1Vmax]             （2）

1. 5 猪胰α-淀粉酶活性抑制率测定

参考Park等（2016）的方法采用3，5-二硝基水杨酸（DNS）还原法，并稍作修改，具体如下：采用0.02 mol/L PBS缓冲液（pH 6.8）配制0.5 mg/mL猪胰α-淀粉酶和1.0%淀粉底物溶液。猪胰α-淀粉酶活性抑制率采用紫外可见分光光度仪测定，取200 ?L嘉宝果果皮提取物或阿卡波糖样品，加入100 ?L a-淀粉酶，摇匀后25 ℃恒温水浴5 min，然后加入200 ?L 1.0%淀粉底物溶液，摇匀后25 ℃恒温水浴10 min，最后加入0.4 mL DNS，立即沸水浴5 min，自然冷却至室温后加入5 mL超纯水稀释，于540 nm处测量吸光值A1，同时设置空白对照组A0（以超纯水代替样品）、空白溶剂对照组A2（以超纯水代替样品和反应试剂）和样品本底组A3（以超纯水代替反应试剂）。根据公式（1）计算a-淀粉酶活性抑制率，并计算IC50。同时，按照上述方法测定阿卡波糖质量浓度为0.030～1.000 mg/mL时，对猪胰a-淀粉酶的抑制率。

1. 6 猪胰α-淀粉酶酶促动力学分析

固定猪胰α-淀粉酶质量浓度（0.5 mg/mL）不变，选用不同质量分数（0.3%、0.4%、0.5%、0.6%和0.7%）的淀粉溶液为底物[S]，以阿卡波糖为对照，在阿卡波糖质量浓度分别为0.100和0.200 mg/mL、嘉宝果果皮粗提物质量浓度分别为0.200和0.400 mg/mL的条件下，測定α-淀粉酶的V，平行测定3次，同时设空白对照组，以超纯水（0 mg/mL）代替阿卡波糖或嘉宝果果皮提取物，通过Lineweaver-Burk双倒数法，以1/V-1/[S]作图，对二者进行线性拟合，并按米氏双倒数方程[公式（2）]计算Vmax和Km，判断酶抑制作用类型。

1. 7 统计分析

采用Excel 2007计算各参数的平均值和标准误差，并绘制回归曲线。

2 结果与分析

2. 1 阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制活性

由图1可知，阿卡波糖质量浓度在5～30 mg/mL范围内，其质量浓度与α-葡萄糖苷酶抑制率呈非线性关系，即随着阿卡波糖质量浓度的增加，抑制率起始升高较快，随后变缓。以质量浓度对α-葡萄糖苷酶抑制率拟合曲线，为对数函数型曲线，R2为0.9994，曲线拟合度好。根据回归曲线y=21.547ln（x）-2.058计算得到阿卡波糖抑制α-葡萄糖苷酶的IC50为11.201 mg/mL。

2. 2 果皮粗提物及其不同极性部位对α-葡萄糖苷酶的抑制活性

嘉宝果果皮粗提物及其不同极性部位对α-葡萄糖苷酶的抑制作用见表1。果皮粗提物及其不同极性部位对α-葡萄糖苷酶均具有较好的抑制活性，在试验质量浓度范围内，抑制率均可达90%以上。以不同质量浓度和α-葡萄糖苷酶抑制率拟合曲线，可得到拟合度高的对数曲线，0.9900≤R2≤0.9938。由表1可知，果皮粗提物及其不同极性部位对α-葡萄糖苷酶的抑制能力大小排序为70%乙醇粗提物（IC50=0.005 mg/mL）>乙酸乙酯部位（IC50=0.020 mg/mL）>正丁醇部位（IC50=0.029 mg/mL）>水部位（IC50=0.242 mg/mL）。乙酸乙酯部位的极性小于正丁醇部位，但其对α-葡萄糖苷酶的抑制作用略强于正丁醇部位，果皮粗提物及其3个不同极性部位对α-葡萄糖苷酶的抑制作用均强于阿卡波糖（IC50=11.201 mg/mL），表现出极强的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

2. 3 α-葡萄糖苷酶酶促动力学分析结果

2. 3. 1 70%乙醇粗提物对α-葡萄糖苷酶的酶促动力学 固定α-葡萄糖苷酶浓度，测定不同PNPG底物浓度[S]下的V，以1/V-1/[S]作图，得到a-葡萄糖苷酶在不添加或添加不同质量浓度嘉宝果果皮粗提物的Lineweaver-Burk双倒数图，如图2-A所示，得到一组相交于第三象限的直线。根据公式（2）可计算出不同质量浓度的果皮粗提物对a-葡萄糖苷酶抑制的Km和Vmax，如表2所示，随着嘉宝果果皮粗提物质量浓度的增加，酶促反应Km和Vmax均减小，可见嘉宝果果皮粗提物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用类型为混合型抑制，需对提取物的不同极性部位分别进行酶促动力学分析，进一步探究果皮粗提物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用类型。

2. 3. 2 阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的酶促动力学

如图2-B所示，a-葡萄糖苷酶在不添加或添加1.000和2.000 mg/mL阿卡波糖时的Lineweaver-Burk双倒数图为一组近似相交于X轴的直线。由表2可知，随着阿卡波糖质量浓度的增加，a-葡萄糖苷酶酶促反应Vmax减小，Km近似不变，可见阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用类型为非竞争性抑制。

2. 3. 3 果皮粗提物不同极性部位对α-葡萄糖苷酶的酶促动力学 固定α-葡萄糖苷酶浓度，测定不同PNPG底物浓度[S]下的V，以1/V-1/[S]作图，得到a-葡萄糖苷酶在不添加或添加嘉宝果果皮粗提物3个极性部位时的Lineweaver-Burk双倒数图，如图3所示，得到3组相互交叉的直线，其中添加果皮粗提物正丁醇部位（图3-A）和乙酸乙酯部位（图3-B）的双倒数直线均相交于第三象限，而添加粗提物水部位（图3-C）的双倒数直线相交于Y轴。根据公式（2）可计算出不同质量浓度的各极性部位对a-葡萄糖苷酶抑制的Km和Vmax，如表3所示，随着果皮粗提物正丁醇部位和乙酸乙酯部位质量浓度的增加，酶促反应Km和Vmax均减小，可见果皮粗提物正丁醇部位和乙酸乙酯部位对α-葡萄糖苷酶的抑制作用类型均为混合型抑制，而不同质量浓度的粗提物水部位其酶促反应的Vmax不变，Km增大，表明水部位对α-葡萄糖苷酶的抑制作用类型为竞争性抑制。

2. 4 阿卡波糖对猪胰α-淀粉酶的抑制活性

由图4可知，在阿卡波糖质量浓度0.030～1.000 mg/mL范围内，以质量浓度为X轴、猪胰α-淀粉酶抑制率为Y轴，获得对数回归曲线y=25.300ln（x）+92.895（R2=0.9878），经计算得到阿卡波糖抑制猪胰α-淀粉酶的IC50为0.184 mg/mL。

2. 5 果皮粗提物及其不同极性部位对猪胰α-淀粉酶的抑制活性

由表4可知，在试验所设质量浓度范围内，嘉宝果果皮粗提物及其不同极性部位对猪胰α-淀粉酶均具有一定的抑制作用，且其抑制效果与质量浓度间呈良好的剂量效应关系，均为对数曲线，0.9820≤R2≤0.9905，曲线拟合度较好，即嘉宝果果皮粗提物及其不同极性部位对α-淀粉酶的抑制作用不随质量浓度的增加不断增强，而是逐渐趋于平稳。果皮粗提物及其不同极性部位对猪胰α-淀粉酶的抑制能力大小排序为70%乙醇粗提物（IC50=0.242 mg/mL）>正丁醇部位（IC50=0.686 mg/mL）>乙酸乙酯部位（IC50=1.426 mg/mL）>水部位（IC50=33.315 mg/mL）。

2. 6 猪胰α-淀粉酶酶促动力学分析结果

2. 6. 1 70%乙醇粗提物对α-淀粉酶的酶促动力学

在酶反应体系中，保持猪胰α-淀粉酶质量浓度为0.5 mg/mL不变的情况下，测定空白对照组及果皮粗提物添加组（0.200和0.400 mg/mL）在底物淀粉不同质量分数[S]下的V，以1/V-1/[S]作图，得到一组近似平行的Lineweaver-Burk双倒数直线图，如图5-A所示。根据公式（2）可計算出不同质量浓度的果皮粗提物对a-淀粉酶抑制的Km和Vmax，如表5所示，随着果皮粗提物质量浓度的增加，酶促反应Km和Vmax均减小，可见果皮粗提物对α-淀粉酶的抑制作用类型为反竞争性抑制。由于果皮粗提物对猪胰α-淀粉酶的抑制作用方式只有反竞争性抑制一种，故未对其不同极性组分做进一步分析。

2. 6. 2 阿卡波糖对α-淀粉酶的酶促动力学 为确定阿卡波糖对α-淀粉酶的抑制类型，固定α-淀粉酶的质量浓度（0.5 mg/mL），测定空白对照组及阿卡波糖添加组（0.100和0.200 mg/mL）在底物淀粉不同质量分数[S]下的V，以1/V-1/[S]作图。如图5-B所示，a-淀粉酶在不添加或添加0.100和0.200 mg/mL阿卡波糖时的Lineweaver-Burk双倒数图为一组相交于第三象限的直线。由表5可知，a-淀粉酶酶促反应的Km和Vmax均随阿卡波糖质量浓度增加而减小，说明阿卡波糖对a-淀粉酶的抑制作用类型为混合型抑制。

3 讨论

人体摄入碳水化合物中的淀粉和多糖在胰α-淀粉酶的作用下分解为寡聚糖，肠道中的α-葡萄糖苷酶可进一步水解寡聚糖为单糖，单糖由肠道吸收进入血液后血糖升高，α-葡萄糖苷酶抑制剂可抑制位于小肠上皮的α-葡萄糖苷酶，使淀粉类分解为葡萄糖的速度减慢，从而减缓肠道内葡萄糖的吸收，降低餐后高血糖。但α-葡萄糖苷酶抑制剂引起的胃肠道不良反应也限制了阿卡波糖等药物的应用（Pranprawit et al.，2015），开发既能有效抑制碳水化合物水解吸收，又能减少腹胀、腹泻等胃肠道不良反应的α-葡萄糖苷酶抑制剂可促进降糖药的发展应用。本课题组前期研究发现，嘉宝果果皮对α-葡萄糖苷酶具有较强的抑制作用，抑制活性甚至超过了阿卡波糖（邱珊莲等，2018），但尚未研究其对α-淀粉酶抑制活性，且前期研究均采用嘉宝果果皮粗提物，未对酶抑制活性部位进行筛选。

本研究采用不同极性有机溶剂依次萃取嘉宝果果皮粗提物，获得粗提物正丁醇部位、乙酸乙酯部位和水部位，并分别测定其对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性。结果显示，果皮粗提物的α-葡萄糖苷酶抑制活性最强，乙酸乙酯部位和正丁醇部位次之，水部位最弱;在α-淀粉酶活性抑制方面，果皮粗提物与阿卡波糖的抑制作用相当，其次为正丁醇部位和乙酸乙酯部位，水部位最弱。有研究报道，多酚能与蛋白结合，改变蛋白质构型从而影响蛋白的生理功能（张莉等，2018）。嘉宝果果皮中多酚含量达556.6 g GAE/kg（Leite-Legatti et al.，2012），因此能较好地抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶等蛋白酶活性。但果皮不同极性部位中多酚类物质的种类、结构和含量存在一定差异，与酶蛋白的结合量、强弱、部位和作用力类型等不同，导致各极性部位对酶的抑制活性存在差异，以中低极性部位的抑制活性强，极性最大的水部位抑制两种酶的效果均最差，说明果皮中中低极性的多酚类物质具有更好的酶抑制活性。此外，蛋白酶的种类不同，也会影响提取物的抑制活性。本研究中，嘉宝果果皮粗提物及其各极性部位对α-葡萄糖苷酶的抑制作用（0.005 mg/mL≤IC50≤0.242 mg/mL）强于阿卡波糖（IC50=11.201 mg/mL），对α-淀粉酶的抑制作用（0.242 mg/mL≤IC50≤33.315 mg/mL）弱于阿卡波糖（IC50=0.184 mg/mL）。该研究结果与多种植物提取物对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制能力结果相似，如金荞麦（Rhizoma fagopyri dibotryis）根茎及其不同极性部位（张兆远和阮洪生，2017）、芡（Euryale ferox）种皮（伍城颖等，2015）和金露梅（Potentilla fruticosa）枝叶（李美华等，2018）等提取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用均强于阿卡波糖，对α-淀粉酶活性的抑制作用均弱于阿卡波糖。但金露梅枝叶提取物和苹果多酚提取物（刘杰超等，2011）对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的IC50较接近，即二者对两种酶的选择性较差;而当嘉宝果果皮粗提物及其各极性部位对α-葡萄糖苷酶有较强抑制活性时，对α-淀粉酶几乎无抑制活性。据报道，α-葡萄糖苷酶抑制剂所引起的胃肠道不良反应可能是过度抑制α-淀粉酶活性引起的（Al-Zuhair et al.，2010），而嘉宝果果皮粗提物及其各极性部位在低浓度时即可有效抑制α-葡萄糖苷酶活性，抑制单糖的水解产生，同时对α-淀粉酶仅有轻微抑制，可避免大量未消化淀粉在肠道发酵产气，引起腹部不适。

酶促动力学研究结果显示，阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用为非竞争性抑制，该结果与吕欢等（2012）的研究结果一致。嘉宝果果皮粗提物的正丁醇部位和乙酸乙酯部位对α-葡萄糖苷酶的抑制作用为混合型抑制，说明正丁醇部位和乙酸乙酯部位中降糖组分较多且作用方式不同，需继续分离纯化，才能进一步确定其对α-葡萄糖苷酶的抑制作用方式;水部位对α-葡萄糖苷酶的抑制作用方式為竞争性抑制，即水部位中的降糖活性成分可竞争性抑制底物PNPG与α-葡萄糖苷酶的结合，作用方式与阿卡波糖不同，推测该活性物质极性较强，且空间结构可能与PNPG较接近。阿卡波糖对猪胰α-淀粉酶的抑制作用为混合型抑制，即阿卡波糖可与猪胰α-淀粉酶多个位点结合后抑制酶的活性，而嘉宝果果皮粗提物对猪胰α-淀粉酶的抑制作用为反竞争性抑制，即果皮粗提物中的活性成分不能与游离α-淀粉酶结合而是与酶—底物复合物结合，说明果皮提取物中能抑制α-淀粉酶的组分较单一或是结构相似的一类化合物，结合果皮粗提物对猪胰α-淀粉酶的抑制活性推测该类化合物属中极性化合物且分子量较接近。

嘉宝果果皮粗提物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用极强，IC50远低于阿卡波糖，对α-淀粉酶的抑制作用与阿卡波糖接近;果皮粗提物按照极性分级后，各极性部位仍表现出对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的选择性，说明嘉宝果果皮粗提物及其不同极性部位均具备降低阿卡波糖引起的胃肠道不良反应的潜力。Lineweaver-Burk双倒数作图法明确嘉宝果果皮及其不同极性对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制作用方式，初步阐明嘉宝果果皮酶抑制机制，补充嘉宝果果皮作为降糖功能因子开发的理论基础。

4 结论

嘉宝果果皮粗提物及其不同极性部位对α-葡萄糖苷酶表现出强抑制性时，对α-淀粉酶的抑制作用较小，对开发具有选择性的α-葡萄糖苷酶抑制剂具有一定的指导意义。

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