秋冬季节变化对情志相关神经递质的影响

李佩佩 刘雷蕾 杨保林 李婷 谈博 王丽涛 韩琦 马淑然

“天人相应”理论是中医学的重要核心理论之一，指人体的生理变化与自然界四季的变化有着同步振荡的关系。课题组前期已经发现松果腺作为“天人相应”的中介在人体与自然界相通应方面起着重要协调的作用，其分泌的褪黑素(melatonin，MT)作为“授时因子”，在机体内外同步共振方面发挥中介作用。研究证明，人和雄性大鼠的MT水平都表现为在秋冬季节高于春季[1-2]。《灵枢·顺一日分为四时》中提到“春生夏长，秋收冬藏，是气之常也，人亦应之”，明确提出秋冬气候变化以阳气收藏为特点，并提到人体存在与之相对应的生理现象。

流行病学调查发现秋冬季节易发抑郁症，Garvey报告显示抑郁症季节性发病率为38%,其中秋冬季节发病者占28%[3]。目前,关于季节变化对秋冬情志类疾病的研究不足，因此本研究在前期基础上进一步探究秋冬季节变化对5-羟色胺(5-hydroxyryptamine，5-HT)、去甲肾上腺素(noradrenaline，NE)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)、谷氨酸(glutamic，Glu)、促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)情绪相关神经内分泌的影响，以探讨“天人相应”理论的微观机制。

1 材料与方法

1.1 动物

健康雄性SD大鼠，5周龄，秋冬季节各24只，共48只。体重150～170 g，分别在秋分(2018年9月23日)、冬至(2018年12月22日)前由斯贝福(北京)生物技术有限公司37日购入，动物合格证号SCXK(京)2018-0002。饲养条件：室温(冬季为17±2℃，夏季为25±2℃)，自然光，自由汲取水及饲料，饲料由普通鼠全价颗粒饲料,购于斯贝福(北京)生物技术有限公司。实验通过北京中医药大学医学与实验动物伦理委员会审查，符合相关伦理学要求，伦理审查编号：BUCM-4-2018111301-1011。

1.2 试剂和仪器

安亭离心机(中国，TGL-16G)；伽马放射免疫计数器(中国，XH6080)；漩涡混合器(美国，Vortex-Genie 2 SI-0246)；牙科打磨机(韩国，saeshin 204)；牙科钻钻头(德国，MEISINGER HM1014)；水合氯醛(中国上海国药集团化学试剂公司)；5-羟色胺酸酶联免疫科研试剂盒(德国Labor Diagnostika Nord公司，批号：BAR-8900)；去甲肾上腺素酶联免疫试剂盒(德国Labor Diagnostika Nord公司，批号：BAE-5500)；γ-氨基丁酸酶联免疫科研试剂盒(德国Labor Diagnostika Nord，批号：BAE-2500)；谷氨酸酶联免疫科研试剂盒(德国Labor Diagnostika Nord，批号：BAE-2400)；促肾上腺皮质激素酶联免疫科研试剂盒(北京北方生物技术研究所)。

1.3 分组及造模

将大鼠随机分为生理组、伪手术组(不摘除松果腺)、手术组(摘除松果腺)，每组8只，伪手术组和手术组分别于秋分、冬至前30天手术造模，与生理组在相同条件下饲养30天。以10%水合氯醛腹腔注射麻醉(用量：0.4 mL/100 g)。待大鼠角膜反射消失后，固定头部，酒精消毒，纵向剪开头皮约2 cm，在矢状缝和人字缝两侧用牙科钻切割矩形骨长约0.5 cm，宽约0.2 cm，暴露矢状静脉窦(sagittal sinus vein，SSV)、横向静脉窦(transverse sinus，TS)和窦汇(collective sinus, CS)。沿SSV两侧纵向切开硬脑膜，结扎SSV上两点，在结扎中间以手术刀切断，靠近CS端，以弯镊伸入取下松果腺，明胶海绵止血，缝合皮肤后滴少量青霉素防止感染，放于笼中单独饲养，即手术组造模成功。伪手术组造模操作过程与手术组大致相同，不同之处是在靠近CS端以弯镊伸入时并不取下松果腺。正常组不给予任何处理措施。

1.4 取材及检测方法

于秋分、冬至当天晚20点开始，暗室内红光5周照明，首先以10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)腹腔麻醉, 腹主动脉采血5～7 mL于普通生化管内，后断头，将鼠头置于盛满碎冰的托盘里，取出大脑置于称量纸上，将海马从脑皮质中分离，后放入冻存管内，-80℃冰箱保存，静脉血以3000 r/min，4℃离心15分钟，取上层血清，-80 ℃冰箱保存，待用。

海马体中5-HT、NE、Glu、GABA、血清ACTH含量测定方法为酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法。

1.5 检测指标

1.5.1 ELISA法检测海马体中5-HT、NE、Glu、GABA含量 待海马组织解冻，称量海马组织0.1g，加入10倍体积PBS缓冲液(0.01M，pH 7.4)，以20℃、3000 r/min，离心10分钟，提取上层清液待用。在对应标准品孔中各加入50 μL标准品，在对应空白孔中加入50 μL样品，各记录编号，在样品孔和标准品孔中加入酶标试剂100 μL。封板后室温下孵育60分钟，洗液洗板5次，每次静置30秒钟，每孔加入A、B两种显色剂各50 μL，室温下显色15分钟。每孔加入50 μL终止液，以空白孔调零，于450 nm下读取各孔OD值。以OD值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。据样品所测得OD值经由标准曲线换算得样品浓度。

1.5.2 ELISA法检测血清ACTH含量 将血清解冻半小时。在样品孔和标准品孔对应加入100 μL液体。每孔加入100 μL稀释液，封膜，室温下孵育震荡15分钟。加入洗液300 μL洗板3次，每次静置30秒。加入100 μL，加100 μL底物至各孔中，室温(20～25 ℃)震荡(600 r/分钟)温育20～30分钟。加入100 μL终止液至各孔中,反应15分钟。450 nm下读取各孔OD值。 以OD值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。据样品所测得OD值经由标准曲线换算得样品浓度。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 秋冬各组大鼠海马组织匀浆中5-HT含量变化

由表1可知，大鼠海马5-HT含量生理组秋分与冬至比较，秋高冬低，有显著差异(P<0.05);正常状态下，5-HT含量存在秋高冬低的季节节律。摘除松果腺后，秋分与冬至手术组相比，无显著差异，即摘除松果腺后5-HT秋高冬低节律被打乱，松果腺可能对5-HT季节节律起调节作用。秋分时5-HT三组数据进行比较，伪手术组>生理组>手术组，组间差异显著(P<0.05)，说明秋季手术和摘除松果腺对大鼠5-HT含量有影响，手术应激会刺激其分泌增加，摘除松果腺后5-HT含量明显下降。冬至时5-HT的含量三组数据相比，手术组>伪手术组>生理组，其中手术组与生理组相比，有显著差异(P<0.05)，伪手术组与生理组相比，无显著差异，说明冬季松果腺对5-HT分泌起调节作用。即在冬季时摘除松果腺对大鼠海马5-HT含量上调作用显著。

表1 秋冬各组大鼠海马组织匀浆中5-HT含量比较

注： 与本组秋分相比，aP<0.05；与同一季节生理组相比，bP<0.05。

2.2 秋冬各组大鼠海马组织匀浆中NE含量变化

由表2可知，大鼠海马NE含量生理组秋分与冬至相比，冬至较高，有显著差异(P<0.05)，说明正常状态下，存在NE含量冬高秋低的季节节律。伪手术组秋分与冬至相比，冬至较高，有显著差异(P<0.05)，说明手术应激情况下，NE含量仍存在冬季高于秋季的季节节律。手术组秋分与冬至相比较，冬至较高，有显著差异(P<0.05)，与正常状态下冬高秋低的节律相同。即手术应激和摘除松果腺均未改变海马NE冬高秋低的季节节律。同季节秋分与冬至三组相比，均无显著差异，说明秋冬季节摘除松果腺对NE调节不显著。从结果看出，摘除松果腺后，无论组间对比还是季节对比，都无显著差异，说明NE分泌水平可能不受松果腺调控，这有待于进一步开展相关研究以探索其季节节律。

表2 秋冬各组大鼠海马组织匀浆中NE含量比较

注： 与本组秋分相比，aP<0.05。

2.3 秋冬各组大鼠海马组织匀浆中GABA含量变化

由表3可知，大鼠海马GABA生理组秋分与冬至相比，秋高冬低，有显著差异(P<0.05)，存在生理状态下，秋高冬低的季节节律。伪手术组秋分与冬至相比，秋高冬低，有显著差异(P<0.05)，说明手术应激反应未改变GABA的季节节律。手术组秋分冬至相比，秋高冬低，有显著差异(P<0.05)，摘除松果腺后与正常状态下节律相同，说明松果腺可能不对GABA的季节节律产生影响。冬至三组相比，生理组>伪手术组>手术组，生理组与手术组相比，手术组含量明显下降，有显著差异(P<0.05)，生理组与伪手术组相比，差异不显著，说明冬季摘除松果腺可能会对GABA的分泌产生影响，松果腺分泌的褪黑素在冬季有促进GABA分泌作用。

表3 秋冬各组大鼠海马组织匀浆中GABA含量比较

注： 与本组秋分相比，aP<0.05；与同一季节生理组相比，bP<0.05。

2.4 秋冬各组大鼠海马组织匀浆中Glu含量变化

由表4可知，海马Glu含量生理组秋分与冬至相比，冬至较高，有显著差异(P<0.05)，存在正常状态下冬季高于秋季的季节节律。伪手术组秋分与冬至相比，差异不显著，手术组秋分与冬至相比，差异不显著。即手术应激反应和摘除松果腺后Glu季节性节律在某种程度上消失或紊乱。同季节相比，秋分时手术组与生理组相比，手术组较高，有显著差异(P<0.05)，伪手术组与生理组相比，差异不显著，说明秋季摘除松果腺后，对Glu含量上调作用显著。

表4 秋冬各组大鼠海马组织匀浆中Glu含量比较

注： 与本组秋分相比，aP<0.05；与同一季节生理组相比，bP<0.05。

2.5 秋冬各组大鼠血清中ACTH含量变化

由表5可知，大鼠血清ACTH含量生理组秋分与冬至相比，秋高冬低，有显著差异(P<0.01)，正常状态下，存在秋季高于冬季的季节节律。伪手术组秋分与冬至相比，有显著差异(P<0.05)，存在冬季高于秋季的季节节律,与生理状态下情况相同。手术组秋分与冬至相比，差异不显著，说明摘除松果腺后，ACTH秋高冬低的季节节律被打乱。同一季节冬至时三组相比，生理组与伪手术比较，有显著差异(P<0.05)，生理组与手术组比较，有显著差异(P<0.05)，冬季摘除松果腺与手术应激对ACTH上调作用显著。秋分时三组相比，均无显著差异，秋季摘除松果腺对ACTH调节不显著。

表5 秋冬各组大鼠血清中ACTH含量比较

注： 与秋分生理组相比，aP<0.05；与秋分伪手术相比，bP<0.05；与同一季节生理组相，cP<0.05。

3 讨论

有实验表明，海马可能是调节情志方药的作用区域[4]。海马区存在调节情志的重要神经解剖结构[5]。有学者[6]最早提出抑郁状态与中枢神经系统内5-HT降低有关。这一假说在后来得到了证实。研究发现抑郁模型大鼠存在海马区5-HT水平降低[7]。有学者[8]早在1965年提出抑郁症是由中枢神经系统中NE不足导致。同时，有研究发现，抑郁症患者血浆中NE含量升高，而非降低。氨基酸类神经递质主要是GABA和Glu参与情志病的发生发展，GABA是存在于中枢神经系统重要的抑制性神经递质，在抑郁患者血浆内发现GABA水平降低[9]。Glu是脑内重要的兴奋性神经递质。研究证实，疏肝解郁方药能够调节海马区GABA水平[10]。外周血中Glu含量降低与抑郁症有关[11]。研究证明，存在抑郁状态下大鼠和人类血浆中ACTH水平增高[12-13]。经抗抑郁治疗后，ACTH水平降低。

松果腺分泌的MT可能是自然界四时与人体五脏相通应的中介。MT可感受外界光线明暗的变化，其内源性合成依赖光周期，自然界四时光照引起MT的季节性变化进而影响五脏的生理功能可能是“五脏应时”的生理机制。前期课题实验也证实了这一点。有研究发现，MT在情志调节和心理应激过程中发挥重要作用[14]。海马、下丘脑所在的边缘系统参与抑郁症的调节，其中信号转导与下丘脑—垂体—肾上腺(HPA)轴有关。因此选择海马中单胺类和氨基酸类神经递质及血清中HPA轴相关神经递质ACTH，通过动物实验探究季节变化对相关神经递质的影响。

3.1 秋冬季节变化对情志相关的神经递质分泌水平存在影响

本研究结果表明，生理状态下，海马5-HT、GABA含量、血清ACTH含量呈现秋高冬低的季节变化规律，具有显著差异(P<0.05),海马NE、Glu含量呈现冬高秋低的季节变化节律，具有显著差异(P<0.05)，说明秋冬季节变化对相关神经递质分泌水平存在影响。在生理状态下，不同的神经递质情志存在不同的季节节律性，这可能与中医理论中“五脏应五时”“五脏主五志”相关，也可能预示秋冬季节抑郁发病的物质基础，是中医“天人相应”的理论微观机制之一。

3.2 秋冬季节松果腺对海马5-HT、Glu、GABA和ACTH分泌有调节作用

5-HT是体内重要的神经递质，在生命节律中起重要的调节作用，属于抑制性神经递质。抑郁症有关5-HT的假说认为，抑郁症是由于中枢神经系统中5-HT释放减少，突触间隙含量下降所致[15]。生理状态下秋冬两季海马5-HT水平秋高冬低，具有显著差异(P<0.05)，秋冬季手术组相比，无显著差异，即摘除松果腺后5-HT的正常节律消失。松果腺分泌的褪黑素对5-HT的季节节律有影响，冬季时三组比较，手术组与生理组相比升高，有显著差异(P<0.05)，伪手术组与生理组相比无显著差异，说明冬季摘除松果腺对5-HT分泌有影响，冬季松果腺对5-HT有调控作用。本实验研究结果表明，NE在正常状态下存在冬高秋低的节律，摘除松果腺后，NE节律仍然存在，秋冬季节摘除松果腺后，与生理组并无显著差异。即秋冬季节海马中NE含量可能不受松果腺调控。

GABA是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制类神经递质，研究表明GABA极其受体水平异常与多种精神类疾病密切相关，如癫痫、阿尔茨海默病和抑郁[16]。Glu为中枢神经系统中兴奋性神经递质，越来越多的实验研究表明，二者之间相对平衡是避免精神类疾病发作的基础，有研究发现，抑郁模型大鼠海马GABA含量明显降低，Glu含量明显上升[17]。

本实验可以看出生理状态下，海马GABA存在秋高冬低的季节节律，而Glu存在秋低冬高的节律。摘除松果腺后GABA水平秋冬季两组相比，秋高冬低，仍有显著差异(P<0.05),与生理状态下相同，说明GABA季节节律可能不受松果腺调控。同样，摘除松果腺后Glu水平，与秋冬季相比，无显著差异，其节律性打乱，说明松果腺对Glu节律有调控作用。冬季时，GABA手术组与生理组水平相比，手术组降低，有显著差异(P<0.05)，伪手术组与生理组相比无显著差异，摘除松果腺后对GABA分泌水平有影响，冬季摘除松果腺后，GABA分泌水平下降，GABA冬季受松果腺调控。秋季三组比较，无显著差异，说明秋季松果腺对GABA调节不显著。秋季时，摘除松果腺后，Glu水平显著升高。冬季摘除松果腺，无明显改变，说明秋季时松果腺对Glu调节显著，冬季调节不显著，与GABA季节调节性相反。

研究证明，降低ACTH水平能够调节神经内分泌网络免疫功能，改善抑郁患者症状[18]。结果显示：生理状态下秋季ACTH水平明显高于冬季(P<0.05)，伪手术组秋冬季相比，秋季高于冬季，具有显著差异 (P<0.05)，秋季生理组与手术组相比，差异不显著，伪手术组与生理组相比，差异不显著，说明秋季松果腺对ACTH调节不显著，这一结论与文献报道一致。冬季生理组与手术组相比差异显著(P<0.05)，手术组高于生理组，伪手术组与生理组相比差异显著(P<0.05)，说明冬季手术创伤和摘除松果腺均能使ACTH一定程度升高。松果腺对ACTH调控具有季节选择性。

3.3 松果腺调控的情志类相关神经递质季节性变化可能是精神类疾病季节发作的基础之一

“天人相应”理论强调“天人合一”思想，指自然界的四季变化与人体四季生理变化相通应。松果腺作为“五脏应时”的中介，发挥了重要作用。本实验通过摘除松果腺观察秋冬季节气候变化对相关神经递质的影响，发现生理情况下，5-HT、GABA具有季节节律性，二者皆呈现秋高冬低的特点，NE、Glu、ACTH存在冬高秋低的节律。摘除松果腺后，5-HT、ACTH和Glu季节节律性消失或发生某种程度的紊乱，表明摘除松果腺后，机体不能“应时而变”，进而导致季节性相关情志疾病的产生。