重楼种子萌发因素分析*

冼康华，付传明，苏 江，黄宁珍，何金祥

(广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所，广西喀斯特植物保育与恢复生态学重点实验室，广西桂林 541006)

0 引言

重楼(Parispolyphylla)是百合科(Liliaceae)重楼属(Paris)多年生草本植物的统称，是一类全草入药的野生名贵中药材，药用历史悠久，在古代的中药材典籍中常称为重台、重楼一支箭、重楼金线、三层草、蚤休、紫河车、铁灯台、七叶一枝花、草甘遂等[1-3]。现李恒系统中，全世界重楼属植物约有26种，12变种，2变型，我国有19种[4]，在浙江、江苏、江西、福建、安徽、湖北、四川、云南、广西、贵州等地均有分布[5-6]，目前中国药典收录使用的重楼正品药源是云南重楼(滇重楼)[ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.) Hand.-Mazz]或七叶一枝花(华重楼)[ParispolyphyllaSmith var.chinensis(Franch.)Hara]的干燥根茎。

重楼个体小、生长慢、成药期长(7-10年)。近年来，随着中医药临床用药和中成药的开发，对重楼的需求大量增加，消耗量远超其野生资源的生长量，在主产地区还出现滥采乱挖现象，导致其野生资源日渐枯竭，价格不断上涨[4，7-8]。由于重楼自然资源日趋减少，加之其经济、药用价值越来越受到人们的重视，许多企业和科研单位已开展药用重楼人工生产与科研方面的工作。重楼通常采用根茎繁殖，但种源稀缺且用量大，难以满足市场需求。种子繁殖是重楼人工繁育的三大途径之一，也是目前我国重楼产业中种苗繁育的主要方式。虽然重楼种子产量大，但由于重楼种子具有“二次休眠”特性，种子发芽周期长，发芽率低，并且出苗时间不一致，出苗不整齐，严重制约重楼产业的发展。近年来关于如何快速促进重楼种子萌发的研究已有不少报道。重楼种皮中含有萌发抑制物，不利于种子萌发，生产上多采用湿沙或草木灰[5]混合的方法搓去外种皮。张旺凡等[9]以井冈山区野生七叶一枝花种子为材料，采用细沙层积冷藏变温处理后再用50-100 mg/L的赤霉素(GA3)处理24 h，以细沙为基质，在20℃温度下催芽60 d后可使发芽率达到90%以上。熊飞[10]采取相似的方法处理七叶一枝花种子，播种后2个月左右即可陆续出苗，出苗率达80%以上，高者可达90%。李晓冬[11]研究发现适宜的层积条件对华重楼种子的萌发具有决定性的影响，华重楼种胚先用 100 mg/L的赤霉素浸泡 24 h，再在 18-20℃中层积 45 d、4℃中层积 30 d、18-20℃中层积 75 d时的萌发用时最短，效果最好，为华重楼种子萌发的最适条件；而最适宜的赤霉素浓度为100 mg/L，高浓度的赤霉素(200 mg/L)反而会抑制华重楼种胚的发育。刘忠辉等[12]的研究结果表明，2 500 mg/L GA3处理七叶一枝花48 h，平均发芽率为50%，萌动时间为53 d。除外加赤霉素、变温层积之外，李海明等[13]采用 100 μmol/L硝普钠处理种子，比对照提前20 d 萌发。姜美杰等[14]则认为华重楼生产上宜采用冷冻法去除种子外种皮，使用0.001%浓度的H2O2浸种14 h后于18℃蛭石中层积，效果最好。也有研究表明，在播种前使用多菌灵浸泡1 h，发芽时间比不浸泡减少3-4个月的时间，发芽率达到85%[15]。不同的研究人员虽然研究结果不一致，但都表明激素和湿润层积对种子休眠解除和萌发促进具有重要作用，也表明重楼种子萌发是一个复杂的过程，影响其萌发的关键因子有待深入探索。本研究选取不同来源的滇重楼和华重楼种子，利用变温层积和植物激素进行处理，探索不同因素不同处理方式对不同来源重楼种子萌发的影响，以期为重楼的产业化推广应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

以不同来源的华重楼3份(分别来自：桂林恭城，四川泸州，桂林灵川)和滇重楼3份(分别来自：桂林恭城，云南低海拔地区，四川泸州)种子为材料(表1)。种子收集时间：10月中旬至11月末，选取的种子果皮变黄开裂，去皮容易，种子饱满。

表1 供试的重楼种子信息

Table 1 Test seeds' information ofParispolyphylla

收集地点Collection place收集时间Collection time千粒质量Thousand seeds weight (g)桂林恭城Gongcheng,Guilin2017 10 1465.96±0.72四川泸州Luzhou,Sichuan2017 10 1540.69±0.52桂林灵川Lingchuan,Guilin2017 11 2935.32±0.28桂林恭城Gongcheng,Guilin2017 10 1465.78±0.72云南低海拔地区Low altitude region of Yunnan2017 11 2343.15±0.40四川泸州Luzhou,Sichuan2017 11 2240.45±0.48

1.2 方法

1.2.1 赤霉素(GA3)对重楼种子萌发的影响

用草木灰拌沙子小心搓洗掉种子红色外种皮后，用1 000倍丰田化工生产的枯萎根腐特效灵浸泡1 min，清水洗净，晾干后用0,50,100,150,200,400,600,800 mg/L的GA3(国药集团化学试剂有限公司)浸泡24 h，之后将种子与沙子按1∶5的体积比例拌匀并置于花盆内，放置于通风凉爽处催芽，保持沙子的湿度在30%-40%(用手抓一把沙子紧握成团，松开即散为宜)。每个处理200粒种子，3次重复。处理后每隔30 d观测一次，连续观测15个月，记录发芽种子数，统计发芽率，发芽率=发芽数/试验播种量(粒)×100%。

1.2.2 变温层积对重楼种子萌发的影响

以来自四川泸州的华重楼、滇重楼和桂林灵川县海洋乡华重楼种子为材料，用草木灰拌沙子小心搓洗掉种子红色外种皮后，用1 000倍丰田化工生产的枯萎根腐特效灵浸泡1 min，清水洗净后用去离子水浸泡24 h，按如下3种方式进行湿沙层积：①种子与沙子按1∶1(V∶V)层积后，通过5℃ 2个月、20℃ 1个月、5℃ 2个月处理后，置于室外通风处催芽；②种子与沙子按1∶5(V∶V)层积后，通过5℃ 2个月、20℃ 1个月、5℃ 2个月处理后，置于室外通风处催芽；③种子与沙子按1∶5(V∶V)层积后，直接置于室外通风处催芽，作为对照。上述各处理保持沙子的湿度为30%-40%。每个处理使用种子200粒，3次重复。每隔30 d观测一次，连续观测15个月，统计发芽率，发芽率=发芽数/试验播种量(粒)×100%。

1.3 统计学分析

试验测得所有数据均采用Excel 2003处理，用SPSS Statistics 19.0 统计软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 赤霉素(GA3)对重楼种子萌发的影响

用不同浓度的GA3对不同来源的华重楼和滇重楼种子进行处理，结果发现6种不同来源的华重楼和滇重楼种子中，仅四川泸州华重楼、四川泸州滇重楼种子和桂林灵川华重楼种子能够萌发，发芽率分别为66.5%-73.0%、72.5%-86.0%和75.5%-83.0%。其中四川泸州华重楼和四川泸州滇重楼种子100 d后观测到萌发(图1 a、c)，桂林灵川华重楼11个月才开始有萌动、12个月后大量萌发，其他种子未见萌发，具体发芽率见表2。采用SPSS19.0分析不同来源、GA3浓度对发芽率的影响，结果可知，来源的F=29.872，P=0.000<0.01，差异极显著；赤霉素浓度的F=1.387，P=0.285>0.05，差异不显著，表明来源不同对种子的萌发有极显著的影响，而赤霉素影响不显著(表3)。进一步对不同来源的种子萌发率进行多重比较，结果如表4所示，从中可知来源3(桂林灵川华重楼)与来源1(四川泸州华重楼)、2(四川泸州滇重楼)的发芽率有显著的差异，来源四川泸州的发芽率显著高于来自桂林灵川的，而来源1(四川泸州华重楼)与来源2(四川泸州滇重楼)无显著差异。说明不同浓度的GA3处理对供试的华重楼和滇重楼种子萌发时间和萌发率的影响并不显著，而种子来源对萌发时间和萌发率的影响极显著。

图1 不同来源重楼种子萌发结果

表2 赤霉素(GA3)对重楼种子萌发的影响

Table 2 Effects of gibberellin on seed germination ofParispolyphylla

GA3浓度Gibberellin concentration(mg/L)发芽率Germination rate (%)华重楼Paris polyphylla Smith var.chinensis滇重楼Paris polyphylla Smith var.yunnanensis桂林恭城Gongcheng,Guilin四川泸州Luzhou,Sichuan桂林灵川Lingchuan,Guilin桂林恭城Gongcheng,Guilin云南低海拔地区Low altitude area in Yunnan四川泸州Luzhou,Sichuan0079.5±1.168.5±0.40080.5±0.750080.5±0.467.0±2.90078.0±0.8100072.5±1.967.0±0.80075.5±1.1150080.0±1.673.0±1.40079.0±1.2200076.5±1.168.0±1.60083.5±1.2400073.0±0.869.0±0.80080.0±1.0600086.0±1.466.5±0.40078.5±0.7800075.0±0.866.5±1.20076.0±0.7

表3 来源和赤霉素浓度对发芽率的方差分析结果(因变量：发芽率)

Table 3 ANOVA results of sources and gibberellin concentration (Dependent variable:Germination rate)

变异来源Source of variationⅢ型平方和SSTypeⅢ sum of squares自由度df均方MSMean squareF值F value显著性Sig.校正模型Corrected model648.094a972.0107.7170.000截距Intercept134 925.0101134 925.01014 458.5560.000来源Source557.5212278.76029.8720.000赤霉素浓度Gibberellin concentration90.573712.9391.3870.285误差Error130.646149.332总和Total135 703.75024校正总和Corrected total778.74023

注：“a”表示R2=0.832(调整R2=0.742)

Note:"a"meansR2=0.832 (adjustR2=0.724)

表4 不同来源间发芽率均数的两两比较(S-N-K法)

Table 4 Pairwise comparison of mean germination rates between different sources (Student-Newman-Keuls)

来源SourceN子集Subset121877.875-2878.875-38-68.188Sig.0.5231.000

2.2 变温层积对重楼种子萌发的影响

从表5可知，3种层积方式中重楼种子均有萌发。其中，四川泸州华重楼种子萌发率最高的是处理③(CK)，萌发率为83%；四川泸州滇重楼种子萌发率最高的是处理②，萌发率为82%；桂林灵川华重楼萌发率最高为60%，以处理②最佳(图1b)。四川泸州华重楼、滇重楼对照处理于层积3个月左右便可观测到种子的萌发，而经变温处理的种子在处理完后50 d可陆续观测到种子的萌发；桂林灵川华重楼则在13个月后才有种子的萌发，且萌发率相对偏低，此外，观测时部分种子消失，可能是较长的沙藏时间导致部分种子因某些因素腐烂死亡。采用SPSS19.0分析不同来源、不同层积方式对发芽率的影响，结果如表6所示。从表6中可知，来源F=74.776，P=0.001<0.01，差异极显著；不同层积方式F=0.276，P=0.772>0.05，差异不显著。表明在种子层积处理时种子的来源对发芽率影响极显著，而层积方式影响不显著。进一步对不同来源的种子萌发率进行多重比较，发现来源3(桂林灵川华重楼)与来源1(四川泸州华重楼)、2(四川泸州滇重楼)有显著差异，而来源1(四川泸州华重楼)与来源2(四川泸州滇重楼)无显著差异(表7)。结果表明变温层积对华重楼和滇重楼种子萌发时间和萌发率的影响并不显著，而种子来源对萌发时间和萌发率的影响极显著。

表5 变温层积方式对重楼种子萌发的影响

Table 5 Effects of stratification methods on seed germination ofParispolyphylla

处理Treat ment发芽率Germination rate (%)四川泸州华重楼Paris polyphylla Smith var.chinensis from Luzhou,Sichuan四川泸州滇重楼Paris polyphylla Smith var.yun nanensis from Luzhou,Sichuan桂林灵川华重楼Paris polyphylla Smith var.chinensis from Lingchuan,Guilin①80.0±0.481.5±0.458.5±1.5②79.5±1.882.0±2.260.0±1.6③(CK)83.0±0.776.5±0.457.5±1.1

表6 来源和层积方式对发芽率的方差分析结果(因变量：发芽率)

Table 6 ANOVA results of source and stratification methods (Dependent variable:Germination rate)

变异来源Source of variationⅢ型平方和SSTypeⅢ sum of squares自由度df均方MSMean squareF值F value显著性Sig.校正模型Corrected model950.667a4237.66737.5260.002截距Intercept48 180.250148 180.2507 607.4080.000来源Source947.1672473.58374.7760.001层积方式Lamination method3.50021.7500.2760.772误差Error25.33346.333总和Total49 156.2509校正总和Corrected total976.0008

注：“a”表示R2=0.974(调整R2=0.948)

Note:"a"meansR2=0.974 (adjustR2=0.948)

表7 不同来源间发芽率均数的两两比较(S-N-K法)

Table 7 Pairwise comparison of mean germination rates between different sources (Student-Newman-Keuls)

来源SourceN子集Subset121380.000-2380.83333-58.667Sig.0.7061.000

3 讨论

重楼种子发芽周期长，发芽率低，且种子具有休眠性。影响重楼种子萌发的因素有温度、光照、内源激素、外源生长调节剂、超声波、紫外线等，外部培养条件改变、内源激素变化、内源酶变化等都会影响种子发芽这一复杂过程。因此，开展对重楼种子萌发影响的研究有较大的实践意义。本研究利用植物激素和层积变温对不同来源的滇重楼和华重楼种子进行处理，结果发现外加赤霉素(GA3)、不同的层积和变温处理均不能显著改善华重楼和滇重楼种子的萌发特性，种子的萌发时间和萌发率高低与种子来源显著相关。有研究表明，在适温条件下，由于重楼种子内部各种激素水平处于平衡状态，外源赤霉素对重楼种子的二次发育没有明显促进作用[16-17]，本研究可能正是由于重楼种子内部各种激素处于平衡状态，导致赤霉素处理不能促进种子的萌发。重楼种子适宜的形态后熟条件为18-20℃的湿润层积，0-10℃的湿润层积有助于打破种子的生理休眠。因此，通过二次变温层积应可以促进重楼种子的萌发。在本研究中，变温处理并未能显著提高种子的萌发率，不经变温处理的对照四川重楼种子在层积3个月左右即可观测到种子萌发，而变温层积的种子(变温处理时间+观测到萌发的时间)共需200 d左右种子才开始萌发，萌发所需时间比对照处理更长。分析认为可能是所选的重楼种子不存在或是存在时间极短的生理休眠，故无需低温打破种子生理休眠；又由于低温会使重楼种子内赤霉素的含量下降[18]，可能打破了重楼种子内部各种激素的平衡状态，使得种子需要更长的萌发时间。

王艳芳等[16]研究不同种子来源对种子萌发的影响，发现主要由于成熟度的差异，不同来源种子的萌发及胚根生长情况差异明显。本研究中选取的种子均为果实成熟后果皮裂开的种子，成熟度差异不大，可以排除种子成熟度的影响。另有研究表明，由于各产地间的温度、光照、降水量、土壤等环境条件各不相同，为适应不同的环境条件，植物可能产生一些遗传变异，并将稳定的遗传变异反映在种子品质上[19]，最终造成不同产地来源的种子萌发不同。朱艳霞等[20]在研究滇重楼种子形态及发芽特性的产地差异时发现，不同产地的滇重楼种子萌发不同，并将20个产地的滇重楼种子划分为3类，第1类来源于贵州六盘水和云南文山，特点是籽粒小、发芽率低；第2类主要来源于广西百色、云南文山，特点是籽粒大、发芽率中等水平；第3类产地包括云南西北部和中部，特点是籽粒中等大小、种子发芽率偏高。本研究选取的6份种子产地分别为广西、云南、四川等重楼主产区，其中来源四川泸州的滇重楼及华重楼，籽粒中等，种子萌发率最高；桂林灵川华重楼，籽粒小，种子萌发率中等；而所选的桂林恭城重楼及云南低海拔地区的滇重楼，籽粒大，种子未能萌发。经统计分析发现四川泸州华重楼、四川泸州滇重楼的发芽率及发芽时间无显著差异，而桂林灵川华重楼与四川泸州重楼种子的发芽率及发芽时间差异极显著。在后续的种质资源收集和种子萌发实验中，发现收集到的云南文山高杆滇重楼种子当年11月与湿沙混合，在室温下贮藏，保持湿度，第二年3月观测，已有大量种子萌发。上述结果表明，重楼种子的萌发时间和萌发率存在明显的地域差异，为适应不同的环境条件，不同产地的重楼可能产生某些遗传变异，造成不同产地来源的种子萌发不同。本研究中种子的萌发时间和萌发率高低与来源显著相关。

本研究未能找到外源激素、层积方式、温度条件等促进重楼种子萌发的明显证据，可能是未找到合适的处理方式或条件，至于这些因素是否能够真正促进重楼种子萌发，则需要更多来源的种子以及更加详细的实验来进一步验证。在自然条件下，滇重楼种子需要两冬一夏才能萌发，15个月的出苗率仅为46.2%[21]，大量种子在漫长的休眠期间丧失了生命力。本研究中四川泸州华重楼、滇重楼，以及后续收集到的云南文山高杆滇重楼，种子只需3-4个月的湿沙贮藏，即可大量萌发，极大缩短了育苗时间，其萌发机理暂未清楚，有待进一步深入研究。因此，研究不同产地的种子萌发特性与质量差异具有重要意义，选择种子萌发快、萌发率高及有效成分含量丰富的优良种质，可以有效缩短重楼育苗时间，有利于促进重楼产业的发展。

4 结论

本研究表明外加赤霉素GA3、不同的层积和变温处理均不能明显改善重楼种子的萌发特性，种子的萌发时间和萌发率高低与种子来源显著相关。今后将对更多来源的重楼种子开展萌发研究，进一步验证种子来源与种子萌发的关系。同时，应该开展重楼种子萌发机理的相关研究，探讨更科学有效的方式促进重楼种子的萌发，提高种子发芽率，为规模化种植提供技术支撑。