豆芽中生长调节剂类违禁添加物的检测方法研究进展

孟继秋 曹金博 孙亚宁 胡骁飞 李兆周 陈秀金 邓瑞广 王 耀

(1. 河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471003；2. 河南省农业科学院动物免疫学重点实验室，河南 郑州 450002)

豆芽作为一种营养丰富的蔬菜，食用方便，价格低廉，因而受到广大消费者的喜爱[1]。豆芽在生长过程中会产生大量的酚类和黄酮类等物质，营养价值高和抗氧化能力强[2]。随着中国芽菜产业迅速发展，“问题豆芽”事件频发[3]，植物生长调节剂的危害也逐渐引起了人们的关注及热议，为确保豆芽及其制品食用安全，根据《中华人民共和国食品安全法》《中华人民共和国农产品质量安全法》等相关法律的规定，原国家食品药品监督管理总局、农业部、国家卫生和计划生育委员会在2015年发布公告，严禁在豆芽生产过程中使用6-苄基腺嘌呤等植物生长调节剂类物质。2018年美国也将6-苄基腺嘌呤在水果蔬菜中的最低限量下调至0.01 μg/g。因此，为了满足食品安全监管的需要，豆芽中生长调节剂检测方法的研究备受重视。文章拟介绍豆芽中常见违禁添加的生长调节剂的作用与危害，并对国内外目前应用较为广泛的检测方法进行综述，以期为豆芽中生长调节剂检测方法的深入研究提供参考。

1 豆芽中主要生长调节剂的作用及危害

豆芽生产过程中违法添加的植物生长调节剂主要有6-苄基氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine，6-BA)、4-氯苯氧乙酸钠(Sodium 4-Chlorophenoxyacetate，4-CPANa)以及2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-D)，其分子结构式如图1所示。6-BA是第一个人工合成的腺嘌呤型细胞分裂素，广泛应用于水果和蔬菜中，可有效增产保鲜，提高质量，延长货架寿命[4]。6-BA还可抑制根的生长，有研究表明，用0.5～25.0 mg/L的浓度处理豆芽可以使其色泽光亮、口感酥脆[5]，并缩短其生长周期[6]。然而6-BA的滥用，不仅使其大量残留于食品中，威胁人身健康[7]，同时也污染环境。6-BA的毒性主要表现在损害生殖系统和神经系统，甚至导致性早熟、急性中毒和癌症[8]。4-CPANa又称防落素，是一种内吸、广谱、高效、多功能植物生长调节剂[9]，作为植物生长调节剂使用时，可抑制豆芽生根、促进生长[10]。其在体内大量蓄积，可诱发肝肾衰竭，心脏肿大，肺部淤血等症状[11]。此外，有研究[12]表明，4-CPANa在不改变血液中激素水平的条件下，可诱导大鼠性腺细胞凋亡。2，4-D是一种苯氧化合物，高浓度时常用作除草剂，低浓度时用作细胞分裂素[13]，用于豆芽的生产时，能缩短发芽期，促进产量，减少须根比例[14]。其在体内的蓄积毒性主要表现为急性充血、内分泌紊乱、中枢神经退化甚至癌症的发生[15]。植物生长调节剂在豆芽中的违规滥用，不仅使其大量残留在豆芽中，同时也随水体、土壤等途径污染环境。

(a) 6-苄基氨基嘌呤 (b) 4-氯苯氧乙酸钠 (c) 2,4-二氯苯氧乙酸

图1 豆芽中主要生长调节剂分子结构式

Figure 1 Molecular formulae of main growth regulators in bean sprouts

2 主要检测方法

目前应用于豆芽中植物生长调节剂的检测方法主要有高效液相色谱法、表面增强拉曼光谱法、电化学方法、免疫分析方法、生物传感器等方法。

2.1 高效液相色谱法

高效液相色谱(high-performance liquid chromatography，HPLC)是一种最常用的色谱分析技术，适用于测定农兽药残留及各种小分子分析物。其检测原理主要是根据待检样品中各成分极性的不同，在色谱柱流动过程中将其分离，并在检测器中分别进行分析[16]。Wang等[17]建立了一种以氧化石墨烯/聚吡咯为吸附剂的高效液相色谱方法对豆芽中6-BA进行了检测，结果表明该方法在44～2 200 ng/g范围内具有良好的线性关系，线性相关系数为0.999 8，回收率在92.5%～103.7%，此吸附剂具有理想的泡沫形貌，不仅保持了石墨烯的层状结构，而且结块较少，大大提高了检测的灵敏度。而Nian等[18]以聚[2-(二甲胺基)甲基丙烯酸乙酯-二甲基丙烯酸乙酯]为固相萃取吸附剂所建立的4-CPANa检测方法，其线性区间为0.2～50.0 ng/mL，回收率为75.0%～93.3%，检测限为1 ng/mL，此方法自动化程度和吸附剂重复使用率高，既节省检测时间又降低检测成本。刘春生等[19]建立了超高效液相色谱—串联三重四极杆质谱法检测豆芽中6-BA与4-CPANa，其检测结果在0.4～100.0 ng/mL区间具有良好的线性关系，检测限分别为0.6，0.9 ng/mL，回收率为80.7%～115.0%。该方法虽然分辨率高、选择性强、假阳性和假阴性率低，检测准确度高，但也存在仪器昂贵和操作繁琐等弊端。

2.2 表面增强拉曼光谱法

表面增强拉曼光谱法(surface-enhanced raman spectroscopy，SERS)是一种高度灵敏的分析检测技术，其原理为吸附在贵金属纳米粒子表面的目标分子在激光的作用下受到局域电场的激发而产生拉曼散射[20]，由于其具有较高的信号增强因子，能达到百万级的光谱增强能力，可以在分子水平提供光谱信息，通常用于痕量分析和检测[21-22]。张萍等[23]采用快速溶剂提取前处理技术与SERS检测技术建立豆芽中6-BA残留物的快速定量检测方法，其结果在0.1～2.0 μg/mL范围内呈现良好的线性关系，检测限为20 ng/mL，回收率为82.3%～95.1%，此方法采用快速溶剂提取的前处理技术，缩短检测耗时，提高检测效率。Wang等[24]利用纳米银作为载体建立SERS检测方法用于检测豆芽中的6-BA，线性范围为10～200 ng/mL，检测限为3.3 ng/mL，回收率为85.5%～113.0%，借助纳米金属粒子，使该方法检测限更低。Zhang等[25]开发出一种便携式表面增强拉曼光谱仪，可用于现场快速检测豆芽中6-BA残留，该方法检测线性范围为0.1～5.0 μg/mL，检测限为0.04 μg/g，回收率为81.7%～95.0%，由于其便携性可直接用于现场检测，使检测过程更加简单、快捷。

2.3 电化学方法

电化学方法是根据不同物质的电化学特性差异，通过测定溶液中的电流、电位等电信号参数，判断被测物成分及含量的一种分析方法[26]，灵敏度高、成本低，反应速度快、试剂用量少、操作简单、仪器使用方便，已被广泛应用于各个领域[27]，但大多数电极材料对植物生长调节剂的氧化还原没有催化能力或催化能力较差，复杂电化学行为以及电氧化和电聚合还会导致强电极钝化(结垢)[28]。因此，为了检测豆芽中的生长调节剂，现多致力于研究和开发新型电极材料。Zhu等[29]开发出一种液体基石墨烯分子印迹聚合物，对6-BA具有较高的催化活性和吸附能力，在优化条件下，电流与6-BA线性关系范围为0.5～50.0 μmol/L，检测限为0.2 μmol/L，回收率为97.3%～108.0%，此方法使用的离子基液体交联剂具有良好的电催化性能，显著提高检测的灵敏度和稳定性。Gan等[30]合成出一种CuO@SiO2空心壳结构，电化学测试结果表明其对6-BA有良好的电催化活性，并以此建立了一种简单、快速的豆芽中6-BA检测方法，峰值电流与6-BA的浓度在50 nmol/L～100 μmol/L范围内呈良好的线性关系，检测限为2.6 nmol/L，回收率为97.2%～107.0%，此材料简单易得、堆积效率高，既缩短检测时间又降低检测成本。Gan等[31]通过将多壁碳纳米管与分子印迹壳聚糖充分混合，然后覆盖在玻碳电极表面，制备了纳米管，在优化条件下，线性范围浓度为0.1 nmol/L～10.0 mmol/L，检测限为50 pmol/L，回收率为91%～103%，此材料会为6-BA提供更多的结合位点，以此材料制备的电极来检测豆芽中的6-BA，受基质效应影响较小，灵敏度更高，检测结果更加准确。

2.4 免疫分析方法

免疫分析方法是基于抗原和抗体之间的特异性识别，利用酶、放射性同位素、荧光素等材料对抗原或抗体进行标记所建立的一种快速检测方法[32]，主要包括酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、免疫印迹(immunoblotting)、免疫层析(immunochromatographic assay，ICA)等，该类方法灵敏度高、特异性强且操作简单，但抗体制备周期较长且高亲和抗体筛选难度大[33]。Zhang等[34]利用6-BA的代谢产物6-苄基腺苷(6-benzylaminopurine riboside，6-BAR)合成免疫原，通过免疫小鼠最终制备能同时特异性识别6-BAR和6-BA的单克隆抗体，并基于此抗体建立了6-BA的间接竞争ELISA检测方法，该方法的线性范围为3.6～106.0 ng/mL，半数抑制浓度(IC50)为18.9 ng/mL，回收率为104%～109%，在豆芽生长后期，部分6-BA已经代谢为6-BAR，此方法亦可通过检测6-BAR间接反映是否添加6-BA。Wang等[35]将SiO2纳米材料结合在包被原上建立了一种直接竞争ELISA方法用于检测豆芽中2，4-D残留，该方法线性范围为1～350 ng/mL，检测限为0.079 ng/mL，平均回收率为93.2%，SiO2纳米材料的使用可有效提高检测灵敏度，降低检测限。Li等[36]基于单克隆抗体开发出一种用于快速检测豆芽中6-BA的胶体金免疫层析试纸，该抗体的IC50为2.25 ng/mL，试纸的检测范围为10～80 ng/mL，该方法不但操作简单，而且在短时间内便可得到肉眼可见的结果，适合豆芽中6-BA的现场快速筛查。

2.5 生物传感器

生物传感器最早于1962年由Clark和Lyons最先提出和使用，主要包括生物识别单元和换能器两个重要组成部分[37]，其原理是将具有特异性识别能力的生物材料固定在固相载体上，形成功能膜，当膜与被测物质接触时，敏感物质首先与被测物质发生选择性吸附，然后发生一系列反应，并将结果转化为电信号，最后由仪器将检测结果直观地表现出来[38]。根据生物敏感单元的不同主要可分为酶传感器、免疫传感器、微生物细胞传感器等[39]，此方法具有敏感性强，准确性高等特点[40]。Lee等[41]利用非标记的光流环谐振器(opto-fluidic ring resonator，OFRR)建立免疫传感器对豆芽中6-BA进行检测，通过优化OFRR毛细管和锥形光缆的制备工艺，制备了纳米级别的OFRR生物传感器，并用金纳米粒子与6-BA抗体结合，通过直接夹心法使检测限降至10 ng/mL。Liu等[42]研究发现2，4-D具有抑制过氧化氢酶的能力，并基于这种抑制能力建立一种2，4-D的快速检测方法，该方法将过氧化氢酶固定于多孔磷酸钙纳米材料上，将2，4-D与过氧化氢同时注入反应体系，由于2，4-D的抑制作用使得过氧化氢的还原电流降低，还原电流与2，4-D浓度在6.63～663.00 ng/mL内呈线性关系，检测限为3.3 ng/mL，该方法准确性好且重复性高。Paolo等[43]利用2，4-D对碱性磷酸酶的抑制作用原理，开发了一种快速、简单、廉价的检测2，4-D的生物传感器，在优化条件下，该传感器的线性范围为2.1～110.0 ng/mL，检测限为1.0 ng/mL，添加回收试验结果表明运用该传感器检测2，4-D具有良好的重现性，此方法所使用的酶传感器相较于免疫传感器具有成本低廉，重复使用率高等特点，整体检测性能更为优异。

3 展望

高效液相色谱、表面增强拉曼光谱等传统的仪器检测方法具有检测限低、准确度高、重复性好等优势，在实验室确证检测中得到了广泛应用，但这些方法仍存在仪器价格昂贵、操作繁琐等弊端，且目前便携式检测装备的研发仍较为缺乏。因此，未来仍须开发简便、快速、灵敏、特异的检测方法，以满足大批量样品快速筛查的需求。相比之下，免疫分析方法和生物传感器法利用高亲和力或强敏感性识别物对目标物进行快速识别，特异性强、灵敏度高且操作简便，在大批量样品的现场快速筛查方面具有极大的优势，若进一步将多种检测手段相互融合，优化检测条件，提高方法准确度和稳定性，并探索利用广谱性识别物建立高灵敏的多残留检测方法，将对植物生长调节剂违法滥用情况的高效监控提供有力保障。