基于柑橘寄主及环境的黄龙病相关研究进展

黄世炎 葛聪聪 邱发发 韦杰 黄桂香 李峰 何新华

摘 要：柑橘黄龙病是一种毁灭性的病害，流行于世界大多数柑橘产区，造成严重经济损失。目前对黄龙病的病源、传播媒介及防控等方面已进行了广泛研究，但黄龙病目前仍难以有效防治。该文以柑橘寄主为主要线索，综述了目前发现的一些耐病性较好的柑橘种质、在植物自身免疫反应中起关键作用的转录因子和基因表达、脱毒苗木在黄龙病防控上的重要性、黄龙病与根际微生物和土壤理化性质相互影响、科学栽培对黄龙病传播的抑制作用及果园地理位置通过影响木虱的活动来影响黄龙病流行等方面的研究进展，为开展黄龙病防控的相关研究提供参考。

关键词：柑橘黄龙病 种质 自身免疫 树体营养 种苗

中图分类号：S436.66            文献标志码：A

Abstract： Candidatus Liberibacter asiaticus CLas is a devastating disease that is prevalent in most citrus producing areas in the world，causing serious economic losses. At present，extensive research has been conducted on the source，vector，prevention and control of CLas，but the disease has not yet been controlled effectively. Taking citrus host as the main clue，this article summarizes the research progress on some new discovered citrus germplasm with good disease tolerance，transcription factors and gene expression that play a key role in plant autoimmune response，and the important role of virus-free seedlings in the prevention and control of CLas，the interaction of rhizosphere microorganisms and soil physical and chemical properties，the inhibitory effect of scientific cultivation on the spread of CLas，and the influence of the geographical location of orchard on the spread of CLas by affecting the activities of psyllids，providing a reference for the research on control of CLas.

Key words：Candidatus Liberibacter asiaticus;germplasm;autoimmunity; tree nutrition; seedlings

柑橘黃龙病（Candidatus Liberibacter asiaticus， CLas），其病原物暂定为α–变形菌纲韧皮部杆菌属（Candidatus Liberibacter）细菌，包括亚洲种（‘Ca. L. asiaticus， CLas）、非洲种（‘Ca. L. africanus，CLaf）和美洲种（‘Ca. L. americanus，Clam）。其中‘Ca. L. asiaticus在世界范围内分布最为广泛，引起柑橘产业损失最为严重，在中国分布的黄龙病病原菌也为该种。对于柑橘是一种极具毁灭性的病害，可引起叶片黄化、果实商品价值降低、树体死亡等严重后果，目前已流行于世界各个柑橘产区，对柑橘产区造成严重经济损失[1]。黄龙病主要通过嫁接、带病苗木和柑橘木虱传播，同时菟丝子也能传播[2]。世界各国都对黄龙病的防治进行了相应的研究，也取得了一定的成果，防治思路和方法主要为抗性品种的筛选、基因技术改良育种、脱毒苗木，化学、物理、生物防治，以及综合统防统治等[2，3]。由于黄龙病病菌难以离体培养，所以目前利用基因技术改良育种方法还没有取得实质性的进展[4]。几乎所有的柑橘属类都能被黄龙病病源所感染，虽然有报道柑橘近缘属有发现抗性植株，但目前并未有抗性柑橘品种培育成功的报道 [5，6]。

该文以寄主为主线，综述了柑橘抗性种质、植物自身免疫反应、种苗、树体营养、根际环境、栽培管理及生长地理环境等与黄龙病相关的研究进展，旨在为开展寄主与黄龙病的相关研究提供借鉴。

1 抗（耐）性种质资源

培育抗或耐黄龙病的柑橘品种是防治黄龙病和挽救黄龙病病区柑橘产业的最佳对策。但目前几乎所有的柑橘属类都能被黄龙病病源感染，只是不同品种感染黄龙病后的症状反应和持续生长能力有所不同。Folimonova  S Y等[7]根据对CLas的症状发展和通过PCR确定细菌滴度，将30个柑橘基因型从敏感到耐受分为四个类型：（1）敏感性，叶片严重褪绿，严重降低生长，最终死亡;（2）有一定耐受性，表现出一些分散明显的症状，但很少或不发生生长下降，植株不死亡;（3）耐受性较好，表现出非常轻微的症状;（4）无症状。Ramadugu  C等[8]为了确定柑橘属Aurantioideae亚科抗HLB的来源，共收集研究了65份柑橘种子和33份属于20个近缘属的种子，最终报告了2个免疫、6个有较强抗性、14个有一定耐受性的种质。在澳大利亚观察到黄龙病抗性/耐受性柑橘亲缘属Eremocitrus和Microcitrus，在亲和性上与柑橘兼容，可为将来的育种试验中提供抗性材料[6，8]。胡燕[9]通过对野生柑橘—宜昌橙和道县野橘及易感甜橙植株分别接种CLas后的生物学症状评价及转录组数据分析表明：与感病甜橙和道县野橘相比，宜昌橙上无明显症状，并且CLas含量相对较低;感病甜橙中差异表达基因及被干扰代谢途径数量最多，道县野橘次之，宜昌橙最少，说明野生柑橘对黄龙病具有潜在的耐病性。

2 植物免疫反应

Yu  Q等[10]通过对接种后7周的粗柠檬和甜橙对模拟接种和CLas接种的反应进行比较转录分析，以鉴定耐受性（粗柠檬）和易感性（甜橙）对CLas感染的早期反应，得出结论：粗柠檬和甜橙可以通过病原体识别受体来识别CLas，甚至在获得CLas的RT-qPCR阳性结果之前就可以激活植物的免疫系统，并证明某些转录因子在抗病性中起关键作用。Wang  Y等[11]使用RNA-Seq评估了黄龙病感染后的耐黄龙病“Jackson”类柚子杂种树和易感的“Marsh”类柚子树的表达差异，实验结果显示，在耐性柑品种中有247个基因高表达，有439个基因低表达;通过分析DE基因的功能类别，也揭示了在HLB耐性柑橘树中多种途径被抑制或激活，从而导致了柑橘植物基础抗性或免疫性的激活。

Albrecht  U等[12]在比较了耐性US-897（Citrus reticulata Blanco×Poncirus trifoliata L.Raf.）和易感 ‘Cleopatramandarin （C.reticulata） 的转录变化的实验中，发现易感的‘Cleopatramandarin （C.reticulata） 幼苗中有大量基因是由于CLas感染引起的，其中许多是与防御相关的基因，表明即使是易感宿主也可以发起防御反应，只是不足以限制病原体在整个植物中的繁殖和传播。

3 种苗

柑橘种苗包含了柑橘类的砧木、种子、种苗、接穗以及成年树[13]。种苗传播是除木虱外的主要传播途径，因此做好种苗的脱毒、检疫工作，使生产上使用无毒的种苗是切断黄龙病传播途径的重要方式，也是减少黄龙病传播源的重要手段。在培育种苗的过程中，幼树由于抽生的新梢较为杂乱，这更有利于木虱的成长和繁殖，因此在育苗的过程中更应做好木虱的防控，以达到培育无毒的苗木[14]。种苗也是在短时间内实现黄龙病远距离传播的主要途径[15]。目前各地也都出台了相关的政策和措施，来把控种苗的安全。事实证明，此举是行之有效的控制黄龙病流行的手段，特别是对非黄龙病疫区，严控带毒种苗进入是最为重要的措施。

Widyaningsih  S等[16]研究了三种砧木品种的嫁接组合：Japansche citroen（Citrus limonia Osbeck）、V olkamer柠檬（C. volkameriana V. Ten&Pasq）、“ Salam”和两个接穗品种：“Siem Pontianak”（C. nobilis Lour）和“ Keprok Tejakula”。 使用“ Keprok Tejakula”（C. reticulata Blanco）检查砧木/接穗组合对黄龙病的影响，得到的结论为：砧木/接穗品种的组合影响植物对黄龙病的耐受性。Bowman  K D等[17]在研究佛罗里达州中部“Valencia”橙受黄龙病侵害相关实验中，也得出利用耐受性较好的砧木是改善柑橘受黄龙病侵害的有效途径的结论。

说明在使用脱毒苗的同时，寻找对黄龙病耐受性好的砧木培育无毒嫁接苗，也是一种减轻黄龙病侵害的一种途径。

4 树体营养

受到黄龙病菌感染的柑橘植株，从肉眼可见的病症描述上来看，叶片褪绿、叶色斑驳和果实畸形等，与锌、铁等的缺素症状极为相似。实际上，黄龙病感染会间接影响植物养分吸收和传送。自柑橘黄龙病发现以来，研究者们对P、K、Ca、B、Mg、Zn、Cu等柑橘生长发育所需元素采用不同方式施用在柑橘黄龙病树上，使柑橘黄龙病病树能有一定时间的保产[18]。Mattos-Jr  D等[19]通过实验发现，在容器中给受到感染的黄龙病植株提供更大剂量的Ca，能提高其淀粉从叶到根的转运;同时实验得出结论：提供高剂量的Ca或Ca+Mg给受感染的植株比提供低剂量的给对照植物具有更高的电子传输速率（ETR）。

受黄龙病影响的植株根部对土壤的酸化作用大于非黄龙病对照，这增加了Cu的利用率并促进了根和叶中Cu的吸收和较高的Cu浓度，其他研究也显示，黄龙病抑制了二价阳离子Ca+，Mg+，Mn+，Zn+，可能也影响Fe的叶面浓度[20]。

有研究发现单纯增加营养元素并不能对柑橘黄龙病病树有良好的防治效果，同时还会带来一系列危害[21]。通过合理施肥可以使果树健壮，可促进结果，减少结果树的新梢抽发，从而减少柑橘木虱为害，降低柑橘木虱传病机率;同时科学施肥可以使其抽发整齐健壮的新梢，这样有利于喷药保护新梢，同时促进新梢生长快速转绿老化，缩短柑橘木虱为害新梢的时间，从而降低柑橘木虱传病机率;在控梢时适度控肥，也可有效控制新梢的抽发生长，减少柑橘木虱对新梢的危害，降低柑橘木虱传病机率[22]。

5 根际环境

Wu   J等[23]研究CLas和P.nicotianae感染的纤维根有关的纤维根损伤和冠层大小的实验中观察到：与对照相比，CLas改变了根生物量的积累，根在感染过程中，根中蔗糖含量阶段性的增或减和冠层尺寸减小。Etxeberria  E等[24]通过扫描和透射电子显微镜，发现所有气生组织中，受黄龙病感染的树木中淀粉的积累量远远超过了黄龙病阴性对照树。受黄龙病影响的树木的根中的淀粉被消耗掉，而对照树木的根中含有大量的淀粉沉积物。同时通过數据分析得出结论：在整个柑橘树中观察到的碳水化合物分配的实质性变化可能不仅是CLas感染的结果。地上部分的淀粉积累是否是以动员根部淀粉为代价而导致的，还是由于CLas感染而导致碳固定能力的增加尚待证实。但是，在韧皮部堵塞的情况下，储备淀粉几乎不可能向上运动。最有可能的是，当仅有少量糖从叶片向下转移，导致根系死亡并最终导致树木衰弱时，根系淀粉被消耗以维持根系的代谢活动。

受到黄龙病侵染的植株根际的微生物菌落受到入侵的病原体的胁迫会改变其结构和多样性。管冠等[25]以晚棱脐橙为材料研究发现，在感染黄龙病中后期，根系逐渐坏死，根系生态失衡。Trivedi  P等[26]通过实验发现黄龙病的感染改变了微生物群落的结构：许多物种显示出降低的水平或未被发现，并被其他本地种群所替代，这些种群可以更好地耐受或适应胁迫条件。Trivedi  P等[27]在改良的EMA-qPCR分析中，发现了六个细菌分离株，它们与有效芽孢杆菌，梭状芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，恶臭假单胞菌，食油微细菌和粘质沙雷氏菌均具有最大的相似性，可显著减少存活的CLas种群。因此Trivedi  P等人认为这些菌的分泌物可提供多种可能性来起到抑制黄龙病的作用。

不同作物生长都有一定范围的最适酸碱度，土壤的不同pH值对植物的生长和发育的影响是显著的[28]。柑橘最适生长pH值范围为5.5 ～ 6.5，适宜生长的酸性范围pH值为4.8 ～ 5.5[29]。土壤过酸，Ca、K等元素易流失，进而引起土壤团粒结构被破坏，导致土壤板结;同时由于土壤中的有益菌最适的生活环境pH为6.5～7.5，因此过酸也会影响土壤有益微生物的活动[28]。而在植物体内也一样有不同的pH值，柑橘和长春花植物的韧皮液中发现的大量有机酸使这两种环境呈弱酸性（柑橘韧皮液的pH值约为6.0，长春花韧皮液的pH值为5.85）[30]。Li  W等[31]在研究黄龙病在柑橘类植物中分布情况的实验中也得出结论：在酸性（或微酸性）环境中可能更有利于CLas的生长。

综上，黄龙病的侵染会破坏植物根际微生物环境和土壤的理化性质，根系的坏死、脱落进一步加剧土壤的理化性质的变化，进而引起树势衰弱，从而使病害侵染和发展加剧。

6 栽培管理

柑橘黄龙病在不防控条件下扩散逐年呈线性上升趋势，全园毁灭只需9年时间。严格执行合理的栽培管理方案，特别是柑橘三梢期的柑橘木虱防治、及时铲除病树、柑橘园精细管理，柑橘黄龙病的扩散就能得到有效的控制[32]。

柑橘木虱有较强的趋嫩性，因此在剪除多余春梢的基础上，再适度的剪除夏、秋梢，以减少柑橘木虱的食料条件，最终达到减少柑橘黄龙病的传播[33]。在进行栽培管理方式对黄龙病流行特征影响的调查中也发现，不同栽培管理方式对柑橘黄龙病的发病流行特征会造成直接的影响。种植户正确适时的剪枝、土壤管理、叶片管理、控梢、优化品种区域化种植都能很大程度上的减轻黄龙病的传播流行[22]。在柑橘园正确的使用防虫网，能有效的隔绝因木虱引起的柑橘黄龙病传播[34]。Gottwald  T  R[35]研究了来自越南、巴西和佛罗里达的一些的数据，种植3年后，无杀虫剂处理的果园黄龙病发病率达到0.96。即使是使用常规杀虫剂的果园，其黄龙病发生率为0.74，而那些每月使用杀虫剂的果园，在种植3年后，其黄龙病发生率为0.24。

Phuyal  D等人[36]以葡萄柚（Citrus paradise）为材料，通过高密度种植和营养疗法实验，得到结论：高密度种植导致树干直径和冠层体积受到制约，尽管在2019-2020年度单棵树单产较低，但高密度种植在单位面积上却带来了最大的水果产量。因此通过高密度种植和适度的施肥是可以在感染黄龙病的早期起到保持一定的经济效益的。

7 生长环境

发病流行情况受生长环境的影响，刘善文等[37]以山地果园进行调查与分析发现，在平地果园中，其发病率在31 %左右，流行指数在14 %左右，山地果园中柑橘植株黄龙病的发病率在33 %左右，流行指数为17 %，柑橘园区的种植环境对其发病率会造成直接的影响。孟幼青等[38]调查了浙江柑橘黄龙病发病情况，得出结论认为，浙江柑橘黄龙病发病情况总体上呈自南而北感染程度逐渐减弱，在浙东南沿海柑橘区更加明显，说明柑橘黄龙病染病发生情况在不同橘区分布差异明显，符合空间分布型测定的要求，其被测柑橘区黄龙病感染病株频次分布适合二项分布，柑橘黄龙病感染病株的空间分布型为聚集分布格局，其聚集强度随阳性病株密度升高而增强。

陈艳玲[39]进行柑橘黄龙病菌在植株不同方位的分布统计分析结果表明，各果园中的不同方向上阳性样品占比各有不相同，四个方位相比较而言，东、南、西三个方向都有占比最高的果园，方位北的阳性样品率在所有果园中均是比较低的。赵学源等[40]在广西调查发现，黄龙病发病区和柑桔木虱分布区大体是一致的，广西北部桂林等地区，种植由病区培育的苗木，也有极少数植株发病，但并未蔓延。这说明受纬度制约的气候因子对黄龙病流行的影响，不是直接表现，而是通过影响柑桔木虱间接起作用的。

8 展望

從以上综述来看，虽然目前依然未见报道有抗性柑橘品种培育成功的报道，但寻找抗性和耐受性较好的种质资源，仍不失为一种从根本上解决黄龙病的途径。此外，探索植物自身免疫机理和进一步研究黄龙病致病机理，或许也能为防治柑橘黄龙病提供更多的可能性途径和方法。同时对黄龙病与柑橘根际环境、树体营养、栽培管理方式以及地理位置相关性的进一步研究和探索，也会为防治黄龙病提供更多有价值的和多方位的参考，以期最终能寻找到有效和根本的防治途径。

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