广东省森林球囊霉素相关土壤蛋白含量及影响因素

权常欣，马玲玲，林钊凯，唐旭利

1. 中国科学院华南植物园，广东 广州 510650；2. 中国科学院大学，北京 100049；3. 华南农业大学林学与风景园林学院，广东 广州 510642

广东省丰沛的水热条件为森林生长提供了良好的条件，森林覆盖率高达58.6%（广东省林业局，2019）。而在热带、亚热带季风气候条件和生物因子的长期作用下，森林土壤普遍呈酸性或强酸性反应，土壤肥力较差，存在盐基离子流失和重金属活化等问题（刘飞鹏，2007），在一定程度上导致了林地生产力低下（任海，2002）。水热条件和土壤条件对植被生长方面的矛盾让人们越来越关注土壤微生物在其中的重要作用。作为土壤中最活跃的组分之一，微生物被认为主要参与土壤有机质的矿化。近年来越来越多的研究证明，土壤微生物是陆地生态系统不可或缺的组成部分，在地球化学物质循环、污染物降解转化和污染环境修复、环境剧烈变化的缓冲等方面发挥着重要作用。土壤微生物生态功能与土壤质量之间存在着密切的联系（林先贵等，2008）。微生物来源的碳在土壤有机碳固持方面起着重要作用（Kallenbach et al.，2015；2016；Woolf et al.，2019）。球囊霉素相关土壤蛋白（glomalin related soil protein，GRSP）是土壤中微生物来源碳的重要组分之一（Treseder et al.，2007a；2013）。GRSP是被认为是丛枝菌根（Arbuscular Mycorrhizae，AM）根外菌丝代谢形成的一种含有金属离子的耐热糖蛋白（Wright et al.，1996）。因其在环境中存在状态稳定而被认为是土壤碳库的重要组成部分（Treseder et al.，2007b）。相比于丛枝菌根真菌（Arbuscular Mycorrhizal Fungi，AMF），GRSP可以在土壤中存留数十年，属于难分解有机碳（Rillig et al.，2003）。GRSP特有的黏线袋结构被认为具有固定土壤中有毒重金属离子，改善土壤结构，改善根际微环境，提高土壤肥力的功能（Treseder et al，2007a；Vodnik et al.，2008；Bendini et al.，2009）。以 GRSP作为切入点，可以为量化AMF在森林生态系统碳循环中的贡献（Zhang et al.，2015），为评价土壤-微生物-根系相互作用对土壤结构的影响（朱永官等，2014）提供参考。

广东省的森林以人工林为主，且多始于上世纪八九十年代“十年绿化广东”造林活动（周国逸等，2000）。森林生态系统的植物物种多样性、生产力和养分利用状况因森林起源、植被类型和土壤类型而存在差异。这些差异将影响包括AMF在内的土壤微生物的组成及动态（Wu et al.，2011；朱兴菲等，2018）。AMF本身周转快，其生物量大小受环境因子影响，不宜作为量化指标进行森林间的比较。GRSP是AMF代谢的产物，结构相对稳定（Rillig et al.，2003），加之AMF普遍存在于陆地生态系统中，因此，GRSP可以作为量化AMF对生态系统物质循环影响的指标（Zhang et al.，2015）。研究区域森林土壤GRSP的量可以反映森林群落组成和结构的差异，亦可体现AMF的生态功能。目前，对于森林土壤中GRSP量、分布格局及其影响因素的研究不多（贺海升等，2015），且已有研究多局限于站点尺度（Zhang et al.，2015；2017；钟思远等，2016，2018；钟思远，2017），鲜有区域尺度的研究。站点尺度的研究表明，常绿阔叶林演替系列森林GRSP含量随演替正向进行而增加，且与土壤有机碳呈正相关关系（Zhang et al.，2017）。在沿海侵蚀台地的研究发现，GRSP含量和土壤团聚体稳定性指数均随植被恢复进程而增加（钟思远，2017）。从养分利用角度的研究表明，植物菌根侵染率随磷胁迫水平而增加（童琳等，2015；钟思远等，2016）。结合站点研究基础和广东省森林分布状况，我们推测，区域尺度土壤GRSP含量受森林起源、群落组成、植物物种多样性的影响而存在差异。GRSP水平也受土壤类型和土壤理化性质差异的影响。

本研究依托中国科学院战略性科技先导专项“应对气候变化碳收支认证及相关问题”（碳专项）设置的森林样地平台（周国逸，2016），选择广东省森林样地为研究对象，通过测定土壤中GRSP含量，分析区域尺度森林土壤球囊霉素相关蛋白含量，评估其对土壤有机碳库的贡献，结合植被、土壤因子探究GRSP分布格局的影响因素，为评价森林生态系统中丛枝菌根真菌对土壤碳固持的影响提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 研究地概况

广东省地处 20°13′—25°31′N 和 109°39′—117°19′E，属南亚热带海洋性季风气候，高温多雨、干湿季节明显，年平均气温 21—22 ℃，最冷月均温 13—14 ℃，最热月均温 28—29 ℃，≥10 ℃积温 6000—8000 ℃；年平均降水量 1600—2000 mm，4—9月是雨季，雨量占全年的80%以上，10月至翌年3月是旱季。日照充足，各地平均每年都在 1800 h以上，年太阳辐射量为 4300—5500 MJ·m-2（徐华勤等，2010）。

1.2 采样及分析测试方法

1.2.1 样地概况及样品选择

按照《森林生态系统固碳研究的野外调查与室内分析技术规范》，在广东省内布设森林样地，于2011—2013年进行调查、采样。土壤样品采集后除去动植物残体和碎石，带回实验室后过2 mm筛，风干保存。另取一部分吹去植物残根，研磨并过100目筛保存。本研究选取其中164个具有植物生物量及物种丰富度数据的森林样地的0—10 cm表层土壤作为实验样品。164个样地分布图如图1所示，样地分布随机分布于广东省，满足森林生态系统最小调查样点数，且充分考虑了森林类型，林龄，优势树种，经营管理方式等因素，样地能够反映广东森林资源的基本状况。按照土壤类型，将土壤养分数据进行分类比较后发现，不同土壤类型间有机碳含量（以质量分数表示，下同）差异明显，呈红壤(37.98 g·kg-1)＞黄壤 (35.43 g·kg-1)＞赤红壤 (26.34 g·kg-1)＞砖红壤 (12.54g·kg-1) 的趋势。全氮（soil total nitrogen，TN）、全磷（soil total phosphorus，TP）变化不明显。砖红壤土壤pH显著高于其他3种土壤。红壤与黄壤的阳离子交换量（CEC）显著高于赤红壤和砖红壤（表1）。按植被起源及植被类型划分后可见，不同起源的森林生物量和物种丰富度的差异仅存在于乔木层，自然林的乔木生物量和物种丰富度均高于人工林，而灌木草本层的生物量和物种丰富度在自然林和人工林间的差异不明显（表 2）。人工林中，针阔混交林的乔木生物量和物种丰富度显著高于常绿阔叶林和针叶林；自然林中，常绿阔叶林的生物量和物种丰富度最高，其次为针阔混交林和针叶林（表2）。

1.2.2 GRSP测定

GRSP的测定采用张静（2014）对Wright提取方法的改进方法，取1 g过2 mm的风干土，用pH为8.0的50 mmol·L-1的柠檬酸钠溶液在121 ℃高温条件下灭菌60 min，后用10000 g×10 min分离上清液，反复提取4次，直至上清液呈淡茶色。易提取球囊霉素相关土壤蛋白采用1 g过2 mm筛的风干土，用pH为7.0的20 mmol·L-1柠檬酸钠溶液在121 ℃高温条件下灭菌30 min，后用10000 g×10 min分离上清液1次。得到上清液后采用考马斯亮蓝法进行标定。

1.2.3 土壤粒径分析

图1 广东省森林样地分布图Fig. 1 Distribution map of forest sample plots in Guangdong Province

表1 广东省森林土壤化学性质Table 1 Soil chemical properties of forests in Guangdong province

表2 广东省样地植被情况Table 2 Vegetation condition of sample plot in Guangdong Province

本研究所采用的土壤为过筛风干土，不能进行团聚体结构的分析，通过分析颗粒组成表征土壤质地的差异。土壤颗粒组成采用激光衍射法（Laser Diffraction，LD）测定。称取过2 mm筛的风干土样 0.1 g，用 H2O2去除有机质后加入 0.5 mol·L-1的NaOH溶液1.5 mL静置过夜后用日本Horiba公司生产的LA950激光粒度仪进行测定。测定粒径范围为0.011—5000 μm。按照美国制土壤粒级划分标准，按照粒径大小将土壤粒级分为粘粒（＜2 μm），粉粒（2—50 μm），砂粒（50—2000 μm）3个等级。

1.2.4 土壤理化性质分析

土壤 pH采用 2.5:1水浸提电位法测定。土壤CEC采用乙酸铵交换法测定；SOC采用重铬酸钾外加热法测定；TN采用半微量开式法测定；TP采用酸溶-钼锑抗比色法测定（刘光崧，1996）

1.3 数据统计分析

采用单因素方差分析（One-way ANOVA）进行检验，结合 Duncan对不同森林起源（自然林和人工林）、植被类型（常绿阔叶林、针阔叶混交林和针叶林）、土壤类型（红壤、赤红壤、砖红壤和黄壤）样地 GRSP及其他理化性质进行比较。用Pearson相关分析检验GRSP与植被、土壤因子的相关性。运用SPSS 25.0和Graphed Prism 8.0软件进行分析和作图。

2 结果与分析

2.1 广东省森林土壤GRSP含量及对SOC的贡献

广东省森林表层土壤（0—10 cm）总球囊霉素相关土壤蛋白（total GRSP，T-GRSP）平均质量分数为 (3.26±0.11) g·kg-1，变化幅度较大，介于0.68—8.37 g·kg-1之间。易提取球囊霉素相关土壤蛋白（easily extractable GRSP，EE-GRSP）质量分数平均值为 (1.11±0.03) g·kg-1，变化范围介于 0.31—3.22 g·kg-1。易提取球囊霉素相关土壤蛋白占总球囊霉素相关土壤蛋白的比例，即 EE-GRSP/T-GRSP为(0.37±0.01)，变化范围介于 0.16—0.96，最大值与最小值相差5倍。

GRSP的含量因样地植被起源、植被类型、土壤类型而异（表3）。人工林的T-GRSP和EE-GRSP含量均略低于自然林的水平[人工林 T-GRSP(3.17±0.13) g·kg-1，自然林 (3.50±0.17) g·kg-1；人工林 EE-GRSP (1.10±0.04) g·kg-1，自然林 (1.15±0.05)g·kg-1]，但差异未达到统计学上的显著水平。针叶林的 T-GRSP 最高 (3.49±0.23) g·kg-1，针阔叶混交林次之 (3.34±0.22) g·kg-1，二者均高于阔叶林的水平 (3.12±0.15) g·kg-1，呈针叶林＞针阔混交林＞常绿阔叶林的趋势。EE-GRSP则呈针阔混交林(1.15±0.07) g·kg-1＞针叶林 (1.12±0.06) g·kg-1＞常绿阔叶林 (1.07±0.04) g·kg-1的趋势。

黄壤中的T-GRSP质量分数 (5.18±0.91) g·kg-1显著高于其他红壤样地的水平（表 3）。黄壤T-GRSP质量分数是红壤的1.5倍，赤红壤的1.6倍，砖红壤的2.2倍。EE-GRSP在不同土壤类型的差异不显著。砖红壤EE-GRSP/T-GRSP比值最高，达 (0.48±0.07)，远高于其他土壤类型（0.3左右），而其他3种土壤类型中EE-GRSP/T-GRSP的比值无差异。

结合前人对GRSP含碳量的研究结果（张静，2014），估算广东省森林表层土壤 GRSP-C含量为(0.56±0.02) g·kg-1，占表层 SOC 的 (2.32%±0.15%)。其中，人工林 GRSP-C对 SOC的贡献率 (2.56%±0.19%) 高于自然林 (1.62%±0.10%)。GRSP对SOC的贡献率因森林类型而不同，针叶林(2.71%±0.25%) ＞常绿阔叶林 (2.16%±0.23%)＞针阔混交林 (1.98%±0.37%)。砖红壤GRSP-C对SOC的贡献率最高 (4.88%±1.36%)，分别是黄壤 (2.89%±0.35%) 的1.7倍，赤红壤 (2.21%±0.12%) 的2.2倍，红壤 (2.14%±0.32%) 的2.3倍。

2.2 GRSP的影响因素

2.2.1 植物生物量和多样性对GRSP的影响

结合群落调查数据，分别从植物群落起源、生物量和物种多样性角度分析植被对GRSP的影响。从起源上看，自然林GRSP高于人工林GRSP（表3），这一趋势与自然林的乔木物种丰富度、生物量、灌草物种丰富度均远高于人工林的水平一致。从群落类型看，不同林型间T-GRSP和EE-GRSP的变化趋势与相应的植被乔木和灌草物种丰富度之间没有协同变化的趋势（图2c、d、g、h）。GRSP受灌木草本生物量的影响超过乔木生物量的影响，灌木草本生物量越大的植被类型，其土壤中GRSP的含量越高（图2a、b、e、f）。比较各植被类型间乔木、灌木草本层生物量及物种丰富度发现，除灌木草本生物量外，其余指标在植被类型间的差异并不显著。针叶林下灌木草本层生物量显著高于常绿阔叶林和针阔混交林，而针叶林GRSP的水平也高于常绿阔叶林和针阔混交林（表3）。

表3 广东省森林0—10 cm表层土壤GRSP质量分数Table 3 GRSP mass fraction of topsoil (0-10 cm) in Guangdong forests

图2 不同森林植被生物量与物种丰富度和GRSP相关指标的关系Fig. 2 Relationships between T-GRSP, EE-GRSP and biomass or species richness in tree layer and shrub and herbaceous layer

2.2.2 土壤理化性质对GRSP的影响

广东省森林GRSP含量因土壤类型而异。黄壤的T-GRSP含量远高于其他土壤类型，而砖红壤的T-GRSP的水平最低，赤红壤与红壤的T-GRSP含量相近。各土壤类型间EE-GRSP含量无显著差异，因而砖红壤易提取组分所占比例远高于其他土壤类型（图3）。

广东省森林土壤GRSP各组分含量及比值与土壤理化性质存在一定的相关性（表4）。T-GRSP和EE-GRSP的含量与SOC含量呈现极显著正相关性关系，说明GRSP是SOC的重要组成部分。GRSP含量与TN、TP无显著相关性。易提取组分所占比例（EE-GRSP/T-GRSP）与SOC、TP和土壤氮磷比值（N:P）呈显著负相关关系。

图3 不同土壤类型GRSP质量分数Fig. 3 Mass fraction of GRSP in different soil types

土壤理化性质中，pH、CEC和土壤粘粒含量均与GRSP含量呈显著相关关系。其中GRSP与CEC呈现极显著正相关关系，与土壤pH和土壤粘粒质量分数呈现显著负相关关系（表4）。进一步以直径50 μm作为土壤细颗粒与粗颗粒的区分标准（贾晓红等，2007），可以看出 GRSP含量随土壤中细颗粒矿物（粘粒和粉粒）含量增加而增加（图4）。

图4 T-GRSP与土壤细颗粒的关系Fig. 4 Relationship between T-GRSP and soil fine particle

3 讨论

3.1 广东省森林土壤GRSP分布格局

广东省森林表层土壤T-GRSP平均质量分数为(3.26±0.11) g·kg-1，低于热带雨林（1—27 g·kg-1）（Lovelock et al.，2004）和次生热带雨林（2—36 g·kg-1）（Woignier et al.，2014）的水平。与 Lovelock et al.（2004）在热带洼地雨林的 3.94 mg·cm-3基本持平，高于中国亚热带北部森林（0.7—1.33 g·kg-1）（Wu et al.，2014a）和温带落叶松林 (2.53±0.09)g·kg-1（黄彬彬等，2019）的水平。大量研究表明，GRSP含量受多种因素，包括环境因子、真菌相关因子和宿主特征，以及它们交互作用的影响（Rillig et al.，2001；Rillig，2004）。与热带雨林相比，广东省森林土壤的GRSP含量较低，是因为广东省地处亚热带南缘，水热条件较热带地区差，森林生产力、多样性也低于热带雨林（罗天祥，1996）。广东省森林土壤GRSP整体水平高于亚热带北部森林和温带的落叶松林，一方面是与亚热带北部和温带森林相比，本区域森林具有较高的生产力和多样性（罗天祥，1996），另一方面也反映了 AMF分布随纬度降低而增加的纬度地带性特征（Soudzilovskaia et al.，2015）。

广东省森林土壤 GRSP-C占表层 SOC的(2.32%±0.15%)，GRSP对 SOC 的贡献（用GRSP-C/SOC比值表示）低于热带雨林（4%—5%，Rillig et al.，2001；3%，Lovelock et al.，2004），高于北方针叶林（1%—2%，Treseder et al.，2007b），亦低于鼎湖山演替系列森林的水平（Zhang et al.，2017）。区域总体较低的 GRSP水平与广东省现有森林为人工林的中幼龄林为主相符。研究表明，演替系列上处于演替初期的马尾松林GRSP含量远低于演替顶级的季风常绿阔叶林的水平 （Zhang et al.，2017）。由此推测，在没有人为扰动及较大自然灾害（如台风、火灾）影响的前提下，随着森林恢复/演替的进行，广东省森林土壤中的GRSP累积量将增加，并将促进土壤有机碳的固持（Zhang et al.，2015）。

3.2 GRSP的影响因素

GRSP被证明是丛枝菌根真菌的代谢产物（Wright et al.，1996），其含量和组成受包括气候条件、植被类型、土壤特性、AMF组成等众多因素的影响。理论上，人工林的生物量与物种多样性低于自然林的水平，AMF的周转速率和丰富度也低于自然林，因此，人工林GRSP的含量应低于自然林水平。我们发现人工林GRSP平均含量略低于自然林，但二者的差异并未达到统计学的显著水平（表3）。一方面可能受样地间空间异质性、土地利用方式、环境条件等因素的影响（王建等，2016）；另一方面反映了群落结构的影响。不同植被类型间 GRSP含量差异不显著，以外生菌根为主针叶林GRSP平均含量要高于常绿阔叶林（表3）。结合乔木层和灌草层生物量及物种多样性综合分析，我们发现，GRSP的含量与灌草层的生物量趋势一致（图2）。这一结果与鼎湖山马尾松林AMF侵染率（78.3%）高于常绿阔叶林（40.7%）的结果一致（郑克举等，2013）。马尾松人工林林下灌木层以阳生性种类如野牡丹（Melastonma candidum）、岗松（Baeckea frutescens）、桃金娘（Rhodomyrtus tomentosa）等为主，盖度 40%，草本层以芒萁（Dicranopteris dichotoma）、纤毛鸭嘴草（Ischaemum indicum）为主，盖度达 60%以上（曹洪麟等，2002）。上述阳生性灌、草层的植物多为AM植物（牛家琪，1990；庄雪影等，1997，2000），它们是表层土壤 GRSP的主要来源。研究发现，广东省森林灌木的丰富度和多样性指数在人工林和自然林中的差异不明显（罗勇等，2014a），但人工林的草本植物多样性略高于自然林（杨海燕等，2014）。针叶林乔木层以松科（Pinaceae）、杉科（Taxodiaceae）植物为主（罗勇等，2014b）。我们认为针叶林下相对较高的GRSP含量是受林内灌木草本层植物的影响所致。广东省森林中针叶林多为人工林（任海，2002），由此我们推测，人工林下丰富的灌木草本植物可能是导致人工林与自然林GRSP差异不明显的原因之一。

GRSP对土壤碳固持的影响通过两个途径实现，一方面，GRSP是SOC的组成成分之一（Treseder et al.，2013）；另一方面，GRSP通过对土壤结构和理化性质的影响延长有机碳的贮存时间（Tresederet al.，2013；朱永官等，2014）。GRSP被大量研究证实具有促进土壤团聚体形成和稳定性的功能（Wu et al.，2014b）。本研究受样品影响，未测定团聚体分组，通过LD法分析土壤颗粒组成情况。土壤颗粒分组和团聚体分组存在一定的差异，但粘粒、粉粒和砂粒是土壤结构最低层次的单个矿物颗粒。土壤颗粒在有机物的胶结作用下形成小团聚体，进一步在生物和物理因素作用下形成较大的团聚体（彭新华等，2003）。因此，颗粒组成分布可以反映土壤质地本身的差异。我们发现随着细颗粒（粒径＜50 μm）含量的增加，GRSP的含量线性增加（图4）。研究发现，GRSP含量与大团聚体（粒径＞2000 μm）含量和土壤结构稳定性指数（mean weight diameter，MWD）呈正相关关系（Yang et al.，2014；钟思远等，2018；Barbosa et al.，2019）。我们推测，作为土壤团聚体的基本组成单元GRSP的黏性有助于土壤颗粒胶结形成团聚体，对包裹在其中的有机碳形成物理保护。细颗粒较粗颗粒具有更高的比表面积，更易与GRSP的结合。在土壤细颗粒含量越高的土壤中，GRSP对土壤结构的改善作用和对SOC的稳定性维持更明显。

本研究表明，不同土壤类型中GRSP的含量存在显著差异（表3）。结合土壤的养分及化学性质发现，GRSP与 SOC、TP、pH、CEC呈显著相关。土壤pH值和CEC被认为是评价土壤酸化程度及保水能力和缓冲能力的重要指标（Adamu et al.，1989；张琪等，2005）。本研究表明GRSP与pH显著负相关，与 CEC显著正相关，这一趋势与土壤 pH和CEC往往呈现出拮抗变化趋势的结论一致（魏孝荣等，2009）。pH对AMF的产孢、侵染定殖、种属分布以及 AM 的形成具有直接影响（盖京苹等，2003）。酸性环境下，土壤中的细菌活性受到抑制，真菌活性被激发，AMF的侵染率、孢子密度，GRSP都增加（高秀兵等，2016）。以上研究均表明，在酸性土壤条件下，植物将更多地依赖于真菌与根系的共生关系，加快获取养分。AMF广泛分布于热带、亚热带土壤中（Soudzilovskaia et al.，2015），与植物根系形成AM，促进系统养分循环，AM的生长自然促进GRSP的累积。土壤CEC是由土壤胶体的表面性质所决定，直接反映了土壤的保肥和供肥性（Adamu et al.，1989；邹凌等，2019）。此外，本研究结果显示，易提取组分占球囊霉素土壤相关蛋白的比值，即EE-GRSP/T-GRSP与TP含量、土壤N:P比都呈显著的负相关关系（表4）。易提取的组分由新近或分解部分产生，EE-GRSP与T-GRSP的比值在一定程度上可以衡量AMF的活跃程度，EE-GRSP/T-GRSP比值越大，说明易提取部分所占比例越大。在磷含量较低的森林生态系统中 AMF更丰富，或周转更快，从而导致磷相对缺乏的土壤中EE-GRSP/T-GRSP比值较高。研究表明，土壤细颗粒与CEC之间的正相关关系具有普遍性（Adamu et al.，1989；邹凌等，2019），本研究结果显示广东省森林土壤中GRSP与CEC呈显著正相关关系（表4），加之GRSP含量随土壤中细颗粒（＜50 μm）比例增加而增加（图 4）。因此，可以推测土壤中GRSP增加将会促进团聚体的形成，提高土壤阳离子交换量（CEC），从而提高土壤保水性能和肥力。

4 结论

广东省森林土壤多为红壤和赤红壤，受区域水热条件影响，土壤淋溶作用强烈，自然酸化严重。本研究发现，GRSP是广东省森林土壤有机碳库的重要组成部分。GRSP含量受土壤理化性质的影响存在明显差异。GRSP对 SOC的绝对贡献率为2.3%，同时，GRSP通过对土壤细颗粒的胶结作用以及对土壤保水性能的改良而间接促进土壤团聚体的形成和土壤肥力的提升，又可为 SOC提供物理保护。我们发现灌木草本层生物量与GRSP含量呈正相关关系，说明林下灌木草本层是土壤 GRSP的主要来源。在森林经营管理，尤其是人工林的提质增效中，应当避免使用林下的方式，尽量保护林下植物多样性，从而促进GRSP的累积，通过GRSP进一步改善土壤结构，提高土壤保水性能和肥力。