秸秆类型及配比变化对污泥厌氧消化中微生物群落的影响

唐涛涛，李江，2，杨爱江，2，杨钊，向福亮，袁华宇

（1贵州大学资源与环境工程学院，贵州贵阳550025；2贵州大学环境工程规划设计研究所，贵州贵阳550025）

污泥和秸秆作为城市和农业固体废弃物，其产量在2016 年和2017 年已达到9.84×108吨和4.328×107吨（含水率80%计）[1-2]。其中，玉米、小麦和水稻秸秆作为主要的农作物秸秆，所占总产量的比例高达83.51%[1]。厌氧消化作为一种高效的生物质能源转化技术，不仅可将污泥和秸秆中的有机物转化为沼气，而且产生的沼液和沼渣也可作为肥料回用于农田，减少化肥使用量。但由于单一厌氧消化存在诸多缺点，如占地面积大、沼气产量低等[3]，因此厌氧消化技术未能被大规模应用于废弃物的处理处置。将多种废弃物混合进行联合厌氧消化不仅能有效平衡营养物质、调节C/N、稳定消化系统的pH，而且还能促进不同微生物的生长繁殖，从而提高厌氧消化效率[4-5]。其中，营养物质与微生物群落结构对提高消化效率起重要作用[6]。

因此，本文基于16S rRNA 高通量测序技术分析秸秆（玉米、小麦和水稻）与污泥进行联合厌氧消化过程中微生物群落结构的演替，揭示秸秆类型及配比变化对污泥厌氧消化体系中微生物群落结构的影响。

1 实验材料与方法

1.1 材料

实验所用污泥采集于贵阳某污水处理厂[序批式活性污泥法（SBR）处理工艺]浓缩池新鲜污泥，在采集过程中利用粒径为100目（0.15mm）的不锈钢筛网进行过滤以去除污泥中的大颗粒物。实验秸秆使用前用破碎机进行打碎，使秸秆粒径小于10mm。污泥与秸秆的基本性质如表1所示。

1.2 实验方法

实验分为10 组，每组各2 个7L 的厌氧消化反应器。反应器的有效容积为5L，采用机械搅拌，并利用温度为(35±1)℃的恒温流动水进行保温和水封；搅拌轴与容器间也采用水封，确保密闭。首次向反应器中投入1/3的消化污泥作为接种污泥，之后按有效容积10%（500mL）投加，直至达到反应器有效容积；以后每天按有效容积5%（250mL）投加污泥，并排出等量消化污泥。在投加污泥过程中，向反应器中通入N2，保持反应器处于厌氧状态。反应器的驯化时间为90 天，以确保各反应器处于稳定状态。随后按VS污泥∶VS秸秆=1∶0（空白对照即污泥单一厌氧消化）、1∶0.5、1∶1、1∶1.5的配比向污泥中添加玉米秸秆（即每250mL 活性污泥加入2.16～10.80g 玉米秸秆）、小麦秸秆（即每250mL 活性污泥加入1.95～9.75g 小麦秸秆）和水稻秸秆（即每250mL 活性污泥加入1.83～9.12g水稻秸秆）；3 个实验组分别标记为C1、C2 和C3，W1、W2 和W3，R1、R2 和R3。待反应器运行稳定后，从反应器底部收集消化污泥用于分析微生物多样性。

表1 污泥与秸秆基本性质

1.3 理化指标的测试

1.4 微生物多样性测试

微生物采用16S rRNA 进行测定，厌氧微生物菌群通过Illumina MiSeq平台（Illumina，SanDiego，USA）进行分析。反应器运行稳定后，向反应器中收集消化污泥用于DNA 的提取（OMEGA-soil DNA Kit，Omega Bio-Tek，USA）；用引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’） 和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’，细 菌）、524F_10_ext （TGYCAGCCGCCGCGGTAA） 和Arch958R（YCCGGCGTTGAVTCCAATT，古菌）进行聚合酶链式反应（PCR）扩增。随后用2%琼脂糖凝胶回收PCR 产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）进行纯化，Tris-HCl 洗脱，2%琼脂糖电泳检测。利用QuantiFluor™-ST（Promega，USA）进行检测定量。最终根据Illumina MiSeq 平台标准操作规程将纯化后的扩增片段构建PE2×300的文库。

1.5 微生物群落结构分析

实验数据采用Microsoft Office Excel 2016 进行处理和分析。微生物数据利用上海美吉云平台（www.i-sanger.com）进行检查分析，筛选有效序列并将相似性≥97%的序列归为同一分类操作单元（OTU），计算多样性指数，并绘制韦恩图（Venn）、微生物Circos图、主成分分析图（PCA）等。

2 结果与讨论

2.1 秸秆类型及配比对消化污泥特性的影响

在收集消化污泥用于微生物群落结构分析前，需保证厌氧体系能稳定运行。而衡量厌氧体系稳定运行的一个关键因素是确保各项参数保持稳定，包括pH、VFAs、- N、碱度（ALK）、VFAs/ALK比值等。由表2可见，秸秆类型及配比的变化虽会对污泥厌氧消化性能产生影响，但各实验组的VFAs、ALK浓度及VFAs/ALK比值并未超过体系的稳 定 运 行 范 围（3000mg/L、 1000～5000mg/L、0.4）[7-9]。因此，秸秆的添加不仅不会破坏体系的稳定性，而且还能极大地增加沼气产量（表2），这与Chen 等[10]的研究结果相似。此外，秸秆的添加均会增加乙酸、丙酸和丁酸浓度，而戊酸浓度会降低。这是因为乙酸、丙酸和丁酸可直接通过碳水化合物和蛋白质发酵产生，而戊酸主要是蛋白质通过还原脱氨或Stickland反应产生[11]。以往的研究也表明，碳水化合物在厌氧环境下更容易发生水解[12-13]。而秸秆富含纤维素和半纤维素，质量分数分别为25%～44.30%和30%～50%[14]。因此，秸秆中的纤维素和半纤维素容易在厌氧环境下水解形成糖类物质，从而导致体系中乙酸、丙酸和丁酸浓度的增加。其中，玉米秸秆的添加对pH、VFAs和乙酸的影响较大；而小麦和水稻秸秆的添加对ALK的影响较大。Chen 等[10]研究也发现，当污泥与玉米、小麦和水稻秸秆进行联合厌氧消化时，玉米秸秆的添加有利于VFAs 的累积；而小麦和水稻秸秆的添加有利于ALK的增加，这与本研究结果相似。但当配比增至1∶1.5 时，各实验组中VFAs 和乙酸浓度均会大幅增加，特别是玉米秸秆。这是因为玉米秸秆添加量高于小麦和水稻秸秆，使得体系中可被生物降解物质（如半纤维素和简单的碳水化合物）的浓度增加，从而导致VFAs 浓度增加。以往的研究表明，累积沼气产量能有效反应物质的水解性能；即较高的累积沼气产量表示物质能更好的水解[15]。在本研究中，玉米秸秆的添加对累积沼气产量的促进作用强于小麦和水稻秸秆；这表明玉米秸秆能更好的水解，并产生高浓度的VFAs。从而与体系中的- N 和ALK 发生中和反应，最终导致- N和ALK浓度降低。

2.2 微生物多样性指数分析

细菌和古菌群落均以97%的相似性作为一个单元来划分，进行OTU（operational taxonomic unit）聚类分析。Coverage 指数是指各样品文库的覆盖率，若Coverage 指数越接近1，代表本次测序结果越接近样本中微生物的实际情况。本研究中细菌的覆盖率为98.79%～99.50%，古菌的覆盖率为99.93%～99.99%（表3 和表4），这表明测序结果能良好的反应各实验组中微生物群落结构的实际情况。

表3 和表4 为各实验组中细菌和古菌多样性指数的评估。ACE 和Chao 指数反映样本中微生物群落的丰度，数值越大，表明菌群丰度越高。表3中ACE 和Chao 指数的增加表明秸秆的添加有利于微生物丰度的增加，但随着配比的增加，微生物丰度并未进一步增加；特别是当污泥与玉米秸秆的配比为1∶1 时不仅没有促进古菌丰度的增加，而且还导致体系中的古菌丰度降低。Shannon 和Simpson指数则反映样品中微生物群落的多样性。表3和表4中Shannon和Simpson指数的变化表明，秸秆类型和配比的变化使得污泥厌氧体系中的微生物多样性发生不同程度的变化。其中，水稻秸秆对微生物多样性的促进作用较强；这表明秸秆类型的变化是导致微生物多样性发生变化的主要影响因素。而以往的研究也证实，共基质特性的不同会导致微生物多样性产生变化[16-17]。

表3 不同实验组中细菌群落的丰度和多样性

表4 不同实验组中古菌群落的丰度和多样性

Venn 图可用于统计多组或多个样本中所共有和独有的物种（如OTU）数目，可以比较直观的表现各样本中物种（如OTU）的组成相似性及重叠情况，如图1所示。由图1(a1)～(a3)可见，与CK相比，同一类型秸秆与污泥在不同配比下各实验组间重叠OTU 的数量分别为863、814 和918。结果表明，水稻实验组中细菌的相似性高于玉米和小麦实验组。图1(a4)～(a6)为不同类型秸秆在不同配比各样品的OTU 分布，在C2 实验组中发现最高的独有OTU 数，这表明当污泥与玉米秸秆配比为1∶1时会使体系产生较多的新型细菌群落。图1(b)为各实验组中古菌群落的OTU。由图1(b1)～(b3)可见，与CK 相比，W1 实验组中含有的独有OTU 数高于其余实验组。同时，由图1(b4)～(b6)发现，W1 实验组中独有的OTU 数也高于其余实验组，这表明污泥与小麦秸秆配比为1∶0.5时对古菌群落的影响较大。

图1 OTU的Venn图

2.3 微生物种群分析

图2 细菌和古菌在门和属水平下的分类

图2为各样品中细菌和古菌在门和属水平下的Circos 图。图2(a)、(b)为不同实验组中细菌和古菌在门水平下的分类，污泥-秸秆联合厌氧消化实验组中主要的细菌门分类为： 拟杆菌门（Bacteroidetes）（17.71%～34.56%）、 变 形 菌 门（Proteobacteria）（10.86%～19.81%）、绿 弯 菌 门（Chloroflexi） （5.86%～15.11%）、 厚 壁 菌 门（Firmicutes）（7.12%～24.02%）、阴沟单胞菌门（Cloacimonetes）（2.22%～14.82%）、降氨酸菌门（Aminicenantes）（0.77%～13.32%）、尚未明确的菌门 （WS6） （2.15%～7.35%） 、 放 线 菌 门（Actinobacteria）（2.81%～6.12%） 和 酸 杆 菌 门（Acidobacteria）（1.35%～5.28%）等，这与以往的研 究 结 果 相 似[10,18]。 其 中 ，Bacteroidetes、Proteobacteria、Chloroflexi和Firmicutes均为优势菌门； 这 是 因 为Bacteroidetes、Proteobacteria、Chloroflexi和Firmicutes对复杂的有机物具有水解和酸化能力，包括蛋白质和碳水化合物[19-24]。在本研究中，随着配比的增加，Bacteroidetes相对丰度逐渐增加，并取代Proteobacteria成为极优势菌门，且当配比为1∶1.5 时促进作用较强。Bacteroidetes作为厌氧消化器中的一种优势菌门，其对氨基酸、甘油、葡萄糖、脂质、碳水化合物、纤维素和半纤维素及其他多糖物质均具有一定的降解能力，并产生VFAs，如乙酸、丙酸、丁酸、琥珀酸、乳酸和长链脂肪酸[25-28]。因此，Bacteroidetes相对丰度的增加能提高乙酸、丙酸和VFAs浓度。与Bacteroidetes不同，秸秆的添加会抑制Proteobacteria的生长，且当配比为1∶1.5 时抑制作用较强。以往的研究表明，Proteobacteria在厌氧消化过程中会消耗乙酸、丙酸和丁酸[29]，故Proteobacteria相对丰度的降低有利于VFAs 的累积。可见，秸秆的添加可通过改变Bacteroidetes与Proteobacteria相对丰度实现体系中VFAs 浓度的增加。同时，秸秆的添加也能促进Synergistetes的生长；其相对丰度由0.15%（CK）分别增至0.65%～1.18%（玉米秸秆）、0.22%～0.39%（小麦秸秆）和0.47%～0.79%（水稻秸秆）。显然， 玉米和水稻秸秆的添加更有利于Synergistetes的生长，且当配比为1∶1.5 时促进作用较强。Zou 等[30]研究发现，Synergistetes能促进VFAs 向乙酸转变。可见，Synergistetes相对丰度的增加能促进体系中乙酸的产生；这与玉米和水稻实验组中乙酸浓度高于小麦实验组的结果相互印证。由图2(b)可见，污泥-秸秆联合厌氧消化实验组中的古菌门分类为：Euryarchaeota（60.00%～79.09%）、WSA2（8.19%～26.81%）和Bathyarchaeota（7.58%～18.65%）。 其 中， 秸 秆 的 添 加 对Bathyarchaeota均具有显著的促进作用（p＜0.001），且随着秸秆添加量的增加而增加，相对丰度由0.16%（CK）增至10.74%～18.74%（玉米秸秆）、7.58%～10.69%（小麦秸秆）和12.30%～18.65%（水稻秸秆）。可见，玉米和水稻秸秆的添加对Bathyarchaeota的促进能力较强。

图2(c)为各实验组中细菌在属水平上的分类。污泥-秸秆联合厌氧消化实验组中的优势细菌属分类主要为未识别的_p_ 降氨酸菌门（norank_p_Aminicenantes）（0.78%～13.32%）、未分类的_p_阴沟单胞菌门（unclassified_p_Cloacimonetes）（2.22%～14.81%）、 未 识 别 的_c_ 拟 杆 菌 门_vadinHA17（norank_c_Bacteroidetes_vadinHA17）（4.82%～11.02%）、norank_p_WS6 （2.15%～7.35%）和Christensenellaceae_R-7_group（2.33%～15.73%）。与CK 相比，秸秆的添加能促进unclassified_p_Cloacimonetes、norank_c_Bacteroidetes_vadinHA17和Christensenellaceae_R-7_group菌属的生长，相对丰度分别由2.16%、3.76%和0.83%（CK）增至2.22%～14.81%、 4.82%～11.02% 和 2.33%～15.73%。 以 往 的 研 究 表 明， Cloacimonetes、Bacteroidetes 与Christensenellaceae（Firmicutes） 对纤维素具有一定的水解能力[31-33]。 因此，unclassified_p_Cloacimonetes、norank_c_Bacteroidetes_vadinHA17 和Christensenellaceae_R-7_group相 对 丰度的增加能促进秸秆中纤维素的水解。其中，当配比为1∶1.5 时，玉米、小麦和水稻秸秆的添加对Christensenellaceae_R-7_group均具有较强的促进作用，且在该配比下水稻秸秆的添加也更有利于unclassified_p_Cloacimonetes和norank_c_Bacteroidetes_vadinHA17 的生长。与水稻秸秆不同，玉米秸秆的添加仅在配比为1∶0.5 和1∶1 时对norank_c_Bacteroidetes_vadinHA17 和unclassified_p_Cloacimonetes具有较强的促进能力；而小麦秸秆在配比为1∶1时 对unclassified_p_Cloacimonetes和norank_c_Bacteroidetes_vadinHA17 具有较强的促进能力。此外，秸秆的添加也能促进部分相对丰度较低的细菌菌 属 生 长， 如norank_f_Porphyromonadaceae、unclassified_f_Ruminococcaceae和Bacteroides；相 对丰度分别由0.06%、0.26%和0.003% （CK）增至0.87%～7.52%、0.61%～1.74%和0.007%～1.40%。以往的研究表明，隶属于Porphyromonadaceae的菌属会产生丙酸[34-35]，这与各实验组丙酸浓度增加的结果一致；Ruminococcaceae对纤维素具有降解能力[36]；而Bacteroides不仅对半纤维素具有较强的分解能力[37]，而且还能以纤维素或纤维二糖作为碳源，并对植物细胞壁中的多糖也具有水解能力[38]。与Christensenellaceae_R-7_group相似，当配比为1∶1.5时，玉米、小麦和水稻秸秆的添加对Bacteroides均具有较好的促进能力。而当配比为1∶0.5时，玉米秸秆的添加对norank_f_Porphyromonadaceae和unclassified_f_Ruminococcaceae具有较强的促进能力，但在配比方面，小麦秸秆的添加仅对norank_f_Porphyromonadaceae具有较强的促进能力。与玉米秸秆不同，小麦秸秆仅在配比为1∶1.5时对unclassified_f_Ruminococcaceae具有较强的促进能力；而水稻秸秆仅在配比为1∶1 时对norank_f_Porphyromonadaceae具有显著的促进能力（p＜0.001）。由此可见，向污泥中添加秸秆能极大地促进体系中水解菌和酸化菌的生长，从而对产甲烷古菌的生长产生影响。

由图2(d)可见，污泥-秸秆联合厌氧消化体系中的优势古菌属分类为：鬃毛甲烷杆菌属（Methanosaeta）（32.01%～61.75%）、未识别的_p_深 古 菌 门（norank_p_Bathyarchaeota）（7.58%～18.74%）、（norank_c_WCHA1-57）（8.15%～26.80%）、（norank_f_ARC26）（3.30%～12.65%）、甲烷杆菌属（Methanobacterium）（2.42%～7.47%）和甲烷瘤球菌属（Methanomassiliicoccus）（2.28%～8.07%）。其中，norank_p_Bathyarchaeota、Methanomassiliicoccus及norank_f_ARC26 的相对丰度会增加（p＜0.001），分别由0.16%（CK）、1.00%（CK）和2.62%（CK）增至7.58%～18.74%、2.28%～8.07% 和3.30%～12.65%。其中，norank_p_Bathyarchaeota的变化趋势与Bathyarchaeota一致；即当配比为1∶1.5 时，玉米、小麦和水稻秸秆的添加均能极大地促进norank_p_Bathyarchaeota的生长。同时，玉米和水稻秸秆在该配比下对Methanomassiliicoccus的生长也具有良好的促进能力。而与玉米和水稻秸秆不同， 小麦秸秆仅在配比为 1∶1 时对Methanomassiliicoccus具有较强的促进作用。He等[39]研究发现，属于Bathyarchaeota的菌属对难降解的大分子物质具有一定的降解能力，如芳香族化合 物 、 纤 维 素 和 蛋 白 质 。 可 见 ，norank_p_Bathyarchaeota相对丰度增加也能促进秸秆的降解。此外，本研究检出的乙酸型产甲烷菌（Methanosaeta）相对丰度会降低（除C2、W3 和R3） ， 氢 型 产 甲 烷 菌Methanospirillum、Methanobacterium（除R2） 和Methanobrevibacter（除W1 和R2） 的 相 对 丰 度 也 会 降 低。 而Methanomassiliicoccus相对丰度会显著增加（p＜0.001），这表明秸秆的添加可能会对污泥厌氧消化体系的产甲烷特征产生影响， 因为Methanomassiliicoccus为甲基型产甲烷菌，主要能利用甲醇（或甲胺）与氢气作为电子供体产生甲烷[40-41]。显然，向污泥中添加秸秆会对乙酸型产甲烷菌和氢型产甲烷菌的生长产生不同程度的抑制作用，但会显著提高甲基型产甲烷菌的相对丰度。综上所述，配比的变化会对体系中细菌群落产生较大的影响，从而改变微生物的生长环境，最终影响产甲烷菌的生长。而Mata-Alvarez 等[42]通过对联合厌氧消化的研究也发现，细菌群落结构易受到原料比例的影响，而甲烷菌更易受到环境条件（如VFAs和- N浓度）的影响。由此可见，污泥与秸秆配比的变化是导致体系中微生物群落发生变化的主要影响因素。

2.4 污泥-秸秆联合厌氧消化与物种关系分析

图3 各样本间的分布热图

图3 为细菌和古菌在属分类上的热图，图3(a)为丰度前50的细菌分布特征。由图3(a)可见，秸秆的添加会产生3 种新的细菌菌属，未识别的_f_拟杆 菌 目_UCG-001 （norank_f_Bacteroidales_UCG-001） 、 丙 酸 杆 菌 属 （Prolixibacter） 和（norank_f_possible_family_01）。其中，Prolixibacter相对丰度高于norank_f_Bacteroidales_UCG-001 和norank_f_possible_family_01，并随秸秆添加量的增加而增加，其相对丰度可达到0.65%～3.99%。由于Prolixibacter对碳水化合物具有降解能力[43-44]；因此，Prolixibacter菌属能促进秸秆的降解。此外，秸秆的添加也能促进Longilinea、Leptolinea、unclassified_f_Anaerolineaceae、norank_c_SJA-15 和norank_f_Synergistaceae的生长。其中，Longilinea和Leptolinea的相对丰度分别由0.017%和0.10%增至0.02%～3.39%和0.18%～1.32%。而以往的研究发现，Longilinea和Leptolinea对多糖具有良好的降解能力[45]；且Longilinea还能将糖转化为有机酸和脂肪酸，并对难降解有机物具有降解能力[46]。可见，Longilinea相对丰度的大幅增加有利于秸秆水解产物的酸化，从而使体系的VFAs 浓度增加。与细菌的属分类相似，秸秆的添加也会产生新的古菌菌属norank_f_Thermoplasmatales_Incertae_Sedis，但仅在W3实验组中检出。显然，秸秆的添加有利于微生物种类、多样性水平和总体数量的增加，但也会对部分菌属产生影响。图4(a)和(b)为细菌和古菌在属分类学上的主成分分析（PCA），结果进一步表明，秸秆类型与配比的变化均会对细菌和古菌属分类产生较大的影响，其中配比的变化是主要的影响因素。

2.5 消化污泥中微生物群落RDA关联分析

图4 细菌和古菌在属分类上的主成分分析

微生物的群落结构不仅受到生物因素的调控，也与非生物因素（如环境因子等） 的影响密不可分。从RDA分析图（见图5）中环境因子箭头的连线长度及环境因子与微生物之间箭头的夹角，可以看出环境因子与微生物群落之间的相关性。由于与样本菌群组成相关的环境因子很多，因此在进行环境因子分析前，需对环境因子进行筛选，保留那些相互作用较小的环境因子。目前，常用的环境因子筛选方法为VIF （variance inflation factor，方差膨胀因子）。而且VIF 值越大，表明自变量间的多重共线性关系越严重；当VIF 值大于10 时被认定为无用的环境因子。如表5所示，经筛选后的环境因子VIF值均低于10，这表明所选环境因子符合分析要求。由图5(a)可见，pH、- N、乙酸和异丁酸对细菌群落的影响较大。 其中，unclassified_p_Cloacimonetes、norank_c_Bacteroidetes_vadinHA17、norank_f_Porphyromononadaceae与 乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸呈正相关关系。Christenseallaceae_R-7_group、Prolixibacter与pH、- N、乙酸、丙酸及丁酸呈正相关关系。由此可见，上述菌群不仅能促进秸秆的降解，而且还能增加乙酸、丙酸和丁酸浓度；这与各实验组中菌属相对丰度和乙酸、丙酸和丁酸浓度增加的结果一致。图5(b)为环境因子与相对丰度前10的古菌菌属的RDA 分析图，与细菌群落不同，乙酸、丙酸、丁酸和异丁酸对产甲烷古菌群落的影响较大。Methanosaeta与- N、乙酸、丙酸和异丁酸呈正相关关系；Methanobrevibacter、Methanobacterium和Methanospirillum与pH 和丁酸呈正相关关系；Methanomassiliicoccus与- N、丁酸、丙酸和异丁酸呈正相关关系。结果表明，乙酸和异丁酸会对微生物群落结构产生较大的影响。

图5 各样本间的RDA分析

表5 环境因子的VIF值

3 结论

（1）秸秆类型及配比的变化会对污泥厌氧消化特性产生影响，但不会破坏体系的稳定运行。其中，玉米秸秆对pH、VFAs和乙酸的影响较大；而小麦和水稻秸秆对碱度的影响较大。但当配比增至1∶1.5 时，各实验组中VFAs 和乙酸浓度均会大幅增加，特别是玉米秸秆。

（2）秸秆类型及配比的变化会对厌氧体系中微生物种类、丰度和多样性产生显著影响，其中，配比的变化是导致微生物群落发生变化的主要影响因素。随着秸秆的添加，部分水解菌和酸化菌的相对丰度会显著提高（p＜0.001），从而促进秸秆的降解；如Bacteroidetes、Cloacimonetes、Bathyarchaeota、Synergistetes（ 门 水 平） 和unclassified_p_Cloacimonetes、norank_c_Bacteroidetes_vadinHA17、Christensenellaceae_R-7_group、norank_f_Porphyromonadaceae、unclassified_f_Ruminococcaceae、Bacteroides、Prolixibacter、Longilinea、Leptolinea、norank_p_Bathyarchaeota（属水平）等。

（3）向污泥中添加秸秆虽然会对乙酸型产甲烷菌和氢型产甲烷菌产生不同程度的抑制作用，但会显著促进甲基型产甲烷菌（Methanomassiliicoccus）的生长（p＜0.001）。

（4）RDA 分析表明，乙酸和异丁酸均会对细菌和古菌菌属结构产生较大的影响。其中，pH、氨氮（- N）、乙酸和异丁酸对细菌群落的影响较大，而乙酸、丙酸、丁酸和异丁酸对产甲烷古菌群落的影响较大。