地中海贫血实验室筛查和诊断方法进展与评价

郑慕阳

（广西壮族自治区江滨医院，广西 南宁 530021）

地中海贫血为临床常见的血液系统疾病，属隐性遗传性血液疾病的一种，由构成红血球基因失常所导致。根据基因受累情况的不同，可将地中海贫血分为α型与β型两种。该疾病包括轻度、中度、重度三种。轻度地中海贫血患者，一般无明显症状，部分患者偶尔可感到体力下降。随着病情的加重，症状逐渐明显，严重甚至可导致寿命缩短。如夫妻双方均为同型基因携带者，胎儿罹患重症地中海贫血的几率为25%左右，疾病目前尚无有效的治疗方法，因此，积极给予预防是关键。临床研究发现，地中海贫血的发生，与遗传以及基因因素有关。在我国，广东及广西地区人群以客家人为主，两地区为地中海贫血的高发区域。及早筛查并诊断，可实现对疾病的预防与控制，对我国新生人口质量的提升，具有积极意义。为达到上述目的，全面改善居民的健康状况，本文对地中海贫血实验室筛查和诊断方法进展进行了总结与评价。

1 地中海贫血实验室筛查方法

地中海贫血实验室筛查方法，包括红细胞渗透脆性实验、血红蛋白组分分析、血常规筛查方法三种，三者的原理、优势与缺陷，主要体现在以下方面。

1.1 红细胞渗透脆性实验 采用红细胞渗透脆性实验筛查地中海贫血，效果值得肯定[1]。该实验原理在于利用红细胞的渗透特征，观察血液标本有无异常[2]。临床研究发现，地中海贫血患者中，90%以上者均伴有红细胞脆性下降现象，脆性低的红细胞，进入低渗盐水溶液中，可发生膨胀，继而破裂[3]。因此，实验中，如发现红细胞膨胀破裂，则可判断患者可能伴有地中海贫血[4]。该筛查方法的优势，在于简单便利，但特异性低，部分肝病患者，血液标本检查时同样可见该现象[5]。

1.2 血红蛋白组分分析 血红蛋白组分分析，同样为临床用于筛查地中海贫血的主要手段。最初，淀粉胶电泳-滤纸电泳，为血红蛋白组分分析的关键技术，但该技术筛查方法不尽人意[6]。随着医疗卫生技术的发展，醋酸纤维膜电泳法出现，虽提高了检出率，但假阳性率较高，且具有分辨率低的缺陷。目前，临床所应用的血红蛋白组分分析方法，以高效液相色谱法为主[7]。该方法具有精确度高、操作简单的优势，且有助于分辨主要变异体，但因检测成本高，故难以在所有医院普及[8]。

1.3 血常规筛查方法 血常规检测，具有便利、简单、成本低廉的优势，临床常采用该方法筛查地中海贫血[9]。采用该方法筛查疾病，临床需对HGB、MCV以及MCH、PLT等项目数值进行观察。地中海贫血患者，往往可见MCV水平下降（一般为82 g/L以下）、MCH水平下降（一般为27 pg以下）[10]。但需注意的是，部分缺铁性贫血患者，血常规检测同样可见上述现象。因此，建议临床结合血清铁等指标，辅助筛查疾病，以免发生误诊，对患者疾病的治疗造成延误[11]。

2 地中海贫血实验室诊断方法

本部分主要归纳了ARMS、PCR、PCR-SSCP、PCRRFLP、PCR-RDB、荧光定量PCR以及ASO技术等地中海贫血实验室诊断方法的特点与应用方法，并对其优势及缺陷进行了对比。

2.1 ARMS ARMS为临床诊断地中海贫血的常用方法，又称多重扩增阻滞突变系统。临床研究发现，该方法诊断的准确率，与反应条件的变化有关[12]。为解决上述问题，部分学者指出，可将甲酰胺加入反应过程中。临床实验表明，采用ARMS诊断地中海贫血，设计4条引物，可实现对HbCS以及HbQS的扩增，判断两者是否存在突变，提高疾病检出率[13]。ARMS技术，具有检测便利性强的特点，且效率较高。目前，该方法已被广泛应用到了临床，并发挥了巨大的价值[14]。另外，采用ARMS技术诊断时，临床仅需提取患者微量DNA样本，便可有效检测，实验设计较为简单，无需对分子进行杂交，无需对放射性核素进行观察，此为ARMS技术的主要优势。该技术用于诊断地中海贫血，同样具有一定的缺陷，主要体现在特异性低方面，诊断时，易出现假阳性与假阴性问题，可能发生误诊或漏诊。

2.2 PCR PCR又称聚合酶链式反应，强调利用DNA聚合酶的功能，作用于成对引物，使两者的特异性DNA片段得到催化，从而达到体外扩增的目的[15]。有学者在研究中指出，该诊断方法的应用，虽可取得较好的效果，但如将其与OR法结合，则可更加准确的检出基因突变型，进一步提升地中海贫血阳性率[16]。荧光PCR为近年来出现的地中海贫血诊断技术，与普通PCR相比，敏感度可高出1000倍以上，实现对正常基因、杂合子、纯合子的辨别。目前，荧光PCR在国内各大医院已有所应用。通过对胎儿羊水或脐带血的检测，可及早发现地中海贫血发生的风险。

2.3 PCR-SSCP PCR-SSCP又称聚合酶链式反应-单链接构象多态性分析，与PCR法相比，该方法要求在DNA体外扩增后，给予单链DNA多态性分析[17]。采用该方法诊断，有助于供临床掌握患者的突变情况。近些年来，测序技术已出现并被应用到了临床，故PCR-SSCP法在地中海贫血诊断中的应用频率逐渐下降。PCR-SSCP诊断地中海贫血，优势在于无放射性核素污染，安全性较强，且有助于使临床及早发现未知点突变。此诊断方法的缺陷在于，对PCR产物的要求较高，如产物＜200 bp，则突变检出率一般为70%-90%。临床可根据该方法的特点，对其进行选择。针对产物＞200 bp者，可考虑选择PCR-SSCP法诊断。

2.4 PCR-RFLP PCR-RFLP又称聚合酶链式反应-限制性内切酶酶谱检测，强调于DNA体外扩增后，对其内切酶进行消化，继而通过电泳的方式，判断基因有无突变。该诊断方法的优势，主要体现在操作较为简单方面。采用PCR-RFLP诊断地中海贫血时，如用于检测小片段缺失及内切酶点改变，效果较好[18]。但单独采用该技术诊断，无法直接测出基因突变型，需联合使用探针，方可最终确诊。可见，此法诊断地中海贫血，具有一定的局限性，难以推广应用。因此，目前聚合酶链式反应-限制性内切酶酶谱检测法在临床的应用较少。

2.5 PCR-RDB PCR-RDB又称聚合酶链式反应-寡核苷酸探针反向斑点杂交，要求利用探针，对DNA进行提取，在此基础上，通过一次性杂交的方式，观察有无基因突变。PCRRDB诊断的优势，在于敏感性强，用于诊断地中海贫血，检出率较高。另外，该方法同样不同于传统杂交法，可单次实现对多种突变进行的检测，便利性强。PCR-RDB诊断方法的缺陷，主要体现在存在假阴性风险方面，易导致漏诊[19]。临床同样发现，PCR-RDB仅可实现对已知位点基因突变的诊断，如突变基因位于未知位点，则不建议采用该方法诊断。因此，为提高地中海贫血的检出率，临床仍需对此方法进行谨慎选择，降低漏诊率，对患者的健康负责。

2.6 荧光定量PCR 荧光定量PCR，为PCR技术的一种，要求于体外环境下，对一对引物进行催化。与PCR相同，该方法同样可实现对基因的体外扩增，从而供临床判断患者的DNA基因表达情况。地中海贫血患者，多伴有部分基因缺失，而大部分研究均发现，α-珠蛋白基因，为缺失基因的常见类型[20]。采用荧光定量PCR对疾病进行诊断，有助于及早发现异常，从而及早采取措施控制病情，改善患者的健康状况。 但该诊断方法，同样存在缺陷。如选取的相对定量与标准曲线存在局限性，诊断结果可能出现误差，增加漏诊以及误诊发生的可能。

2.7 ASO ASO技术又称探针斑点杂交技术，该技术要求获取PCR扩增产物，后将其点于尼龙膜上，继而对基因进行区分，将其分为突变与正常两种。临床研究发现，采用该技术诊断地中海贫血，能够对正常与突变的ASO进行鉴别，并使两者杂交。探针不完全互补的情况下，如条件允许，具有完全洗脱的可能。此时，观察杂交结果，便可实现对地中海贫血的诊断。该诊断方法，优势，主要体现在假阴性与假阳性均较低、特异性高方面。另外，采用ASO法诊断疾病，同样具有灵敏度高、检测便利性强以及检查结果获取速度快的优势，临床可对其进行应用。但该诊断方法，同样具有一定的缺陷，具体体现在对DNA纯度与数量要求高、存在放射性污染方面。每次杂交仅能够实现对一种突变的检测。地中海贫血中，β型具有异质性高的特点，采用ASO法诊断时，需频繁对探针进行更换，方可确诊疾病。

综上所述，采用红细胞渗透脆性实验、血红蛋白组分分析等方法，对地中海贫血进行筛查，可及时发现疾病发生的风险。但根据筛查方法的不同，其优势与缺陷同样存在差异。临床可根据医院的条件，以及患者的需求，对不同筛查方法进行选择，及早发现地中海贫血的风险。单独采用上述方法筛查，难以确诊地中海贫血。因此，临床还需在此基础上，利用ARMS、PCR、PCR-SSCP等方法诊断，则可提高疾病检出率。临床应加强对各类诊断方法的点的重视，与此同时，将筛查与基因诊断法结合，全面提升地中海贫血的检出率，为居民健康状况的改善提供保证。此外，还需重点对广东、广西两省孕妇进行筛查，如发现胎儿存在罹患地中海贫血的风险，需考虑及早采取措施干预，或考虑引产，提升我国新生人口质量。