基于全程质量控制理念的杜仲颗粒特征图谱研究

马永青，王璐，刘颖，刘永利

摘要：為明确杜仲颗粒生产过程中水溶性成分的转移情况，提供更为全面的质量控制方法，采用HPLC法对杜仲饮片、杜仲叶饮片、标准煎液与杜仲颗粒的特征图谱进行了相关性评价。使用Phenomenex（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，以乙腈0.1%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱，检测波长为227 nm，柱温为30 ℃，流速为1.0 mL/min，考察提取方式、提取溶剂及时间的影响。结果表明，选用超声提取方式，以甲醇作为提取溶剂，反应时间为20 min时获得的效果较好;在此优化条件下建立特征图谱分析方法，能够使得杜仲颗粒的药效物质基础与药材保持一致，样品质量稳定，制备工艺规范，几个特征峰可全部在饮片中得到追溯，各共有峰的相对保留时间小于0.5%。所建立的特征图谱专属性强，重复性好，可有效鉴别和评价杜仲颗粒的质量，为制定系列品种的全面质量控制方法提供参考。

关键词：中药化学;高效液相色谱法;杜仲饮片;杜仲叶饮片;杜仲颗粒;特征图谱

中图分类号：R917文献标识码：Adoi： 10.7535/hbgykj.2020yx01010

Characteristic chromatogram of Duzhong granules on

whole process quality control concept

MA Yongqing1， WANG Lu1， LIU Ying2， LIU Yongli1

（1. Hebei Institute for Drug Control， Shijiazhuang， Hebei 050011， China;2. Hebei Province for Food and Drug Evaluation Certification Center， Shijiazhuang， Hebei 050011， China）

Abstract：In order to clarify the transfer of watersoluble components in the production process of Duzhong granules and provide a more comprehensive quality control method， HPLC method is used to evaluate the correlation between the characteristic maps of Eucommiae Cortex，Eucommiae Folium，standard decoction and Duzhong granules. The analysis is performed on Phenomenex C18 column （4.6 mm×250 mm， 5 μm）， with acetonitrile0.1% phosphoric acid aqueous solution as the mobile phase for gradient elution. The detection wavelength is set at 227 nm， the column temperature is maintained at 30 ℃ and flow rate is 1.0 mL/min. The effects of extraction method， extraction solvent and reaction time are investigated. The results show that the ultrasonic extraction method is selected， methanol is used as the extraction solvent， and the reaction time is 20 minutes. The analysis method of Duzhong granules characteristic map is established under the optimized conditions. The effective substance basis of Duzhong granules is consistent with that of medicinal materials， the sample quality is stable， the preparation process is standard， several characteristic peaks could be traced all in the decoction pieces， and the relative retention time of each common peak is small at 0.5%. The established characteristic map has strong specificity and good repeatability， which can effectively identify and evaluate the quality of Duzhong granules， and provide a certain reference for the quality detection methods of a series of varieties.

Keywords：chemistry of Chinese material medica;HPLC; Eucommiae Cortex; Eucommiae Folium; Duzhong granules; characteristic chromatogram

杜仲与杜仲叶分别为杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv.的干燥树皮、干燥叶，具有补肝肾、强筋骨、安胎之功效，用于肝肾不足、腰膝酸痛、筋骨无力、头晕目眩、胎动不安等症的治疗[1]。目前针对不同产地杜仲及杜仲叶中主要有效成分含量的报道较多[23]。杜仲饮片及杜仲叶饮片HPLC指纹图谱的初步建立，可有效控制药材的内部质量[45]。另外，研究发现盐制过程对杜仲中环烯醚萜类及木脂素类成分的影响明显[6]。中成药质量影响因素较多，如原药材质量、投料饮片质量、提取制备工艺等。已有文献报道的质量控制多集中在对成品质量标准的研究上[712]，对杜仲颗粒质量全程控制的研究鲜有报道。

中药特征图谱技术能够表征中药整体质量信息，反映中药复杂的化学成分，在有效成分尚未完全阐明的情况下，有效表征中药质量，适用于控制中药生产过程各环节中间体及成品质量[1317]。本研究采用HPLC法建立杜仲颗粒的特征图谱，考察杜仲颗粒生产过程重要环节中药材和杜仲颗粒水溶性成分的转移情况。

1主要仪器与试药

1.1仪器

Waters e2695色谱仪（美国Waters公司）;MilliQ超纯水机（美国Millipore公司）;TOLEDO XS105电子分析天平（瑞士Mettler公司）。

1.2试药

松脂醇二葡萄糖苷（中国食品药品检定研究院提供，批号为111537200501）;绿原酸（中国食品药品检定研究院，批号为110753201415，含量以962%计）;杜仲颗粒，规格为每袋装5 g;乙腈（色谱纯，Merck KGaA公司提供）;其他试剂均为分析纯;10批杜仲颗粒样品由生产厂家提供。

2方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：Phenomenex（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相：以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相B;采用梯度洗脱方式：0～5 min，5%A;5～30 min，5%→15%A;30～45 min，15%→20%A;柱溫：30 ℃;流速：1 mL/min;检测波长：227 nm。

2.2溶液制备

2.2.1混合对照品溶液

取绿原酸对照品、松脂醇二葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含绿原酸150 μg、松脂醇二葡萄糖苷20 μg的混合溶液，即得。

2.2.2杜仲颗粒供试品溶液

取本品内容物，研细，取约2 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，超声处理（功率250 W，频率50 kHz）20 min。放冷，摇匀，取续滤液，即得。

2.2.3杜仲饮片、杜仲叶饮片与标准煎液供试品溶液

取杜仲饮片、杜仲叶饮片及处方药味（杜仲对照药材0.5 g、杜仲叶对照药材2.5 g混匀），加水煎煮1 h，离心，取上清液加2.8倍乙醇使其沉淀。再次离心，将上清液调整至约30 mL，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

3方法学考察

3.1杜仲颗粒特征图谱的建立及分析

取10批杜仲颗粒，按“2.2.2”项所述方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进行分析，确定色谱图中出峰时间基本一致、峰面积较大的5个峰为共有特征色谱峰。通过与对照品比对，确认2号峰为绿原酸，4号峰为松脂醇二葡萄糖苷。其中2号峰峰形较好，前后无杂质峰干扰，分离完全，出峰时间居中，选其作为参考峰，见图1。

此外，通过比较杜仲颗粒与原药材HPLCDAD的色谱图，明确了1号—3号共有峰来源于杜仲与杜仲叶，4号共有峰来源于杜仲，5号共有峰来源于杜仲叶。将杜仲饮片、杜仲叶饮片、标准煎液、杜仲颗粒图谱进行比较可知，与杜仲、杜仲叶药材指标成分相关的主要色谱峰在标准煎液及杜仲颗粒色谱图中均能得到体现;同时，杜仲颗粒中主要色谱峰也能在药材提取物图谱中得到追溯。10批杜仲颗粒HPLC特征色谱，以及杜仲饮片、杜仲叶饮片及标准煎液的HPLC色谱图见图2—图3。

3.2重复性试验

取同一批样品，研细，各取1，2，3 g共3份，按“2.2.2”项所述方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进行测定。结果表明，本方法保留时间的重复性良好，结果见表1和表2。

3.3稳定性试验

取“2.2.2”项制备的供试品溶液，分别放置0，8，16，24 h后，按“2.1”项色谱条件进行分析，以绿原酸为参照峰，计算特征图谱中各共有峰的相对保留时间。结果显示，各共有峰的相对保留时间小于05%，表明该溶液在24 h内稳定。

4讨论

4.1检测波长的选择

杜仲颗粒成分复杂，主要有效成分紫外吸收差异较大。为保证各共有峰具有适宜的灵敏度和精密度，采用二极管陈列PDA检测器在200～400 nm下进行各波长扫描。结果表明，在227 nm处基线稳定，各共有峰在同一波长下均有较好的吸收，干扰较小，且低含量组分松脂醇二葡萄糖苷的检测灵敏度好，峰型好。

4.2提取方法的选择

通过实验比较了甲醇、70%甲醇、水、乙醇4种提取溶剂的提取效果。结果表明，采用甲醇作为提取溶剂时所得色谱峰的分离效果较好，响应值较高。以甲醇作为提取溶剂，对回流和超声提取方式进行考察的结果表明，两者的提取效果并无明显差异。此外，通过实验比较了提取时间对提取效果的影响。综合考虑，确定采用操作简单的超声提取方法，以甲醇作为提取溶剂，超声时间为20 min。

4.3流动相选择

实验中比较了甲醇水、乙腈磷酸水等多个流动相系统。结果显示，采用乙腈0.1%磷酸溶液时峰型对称，可获得较高的理论塔板数，分离度也都达到要求。因此，选择乙腈0.1%磷酸溶液作为流动相。

5結语

1）杜仲、杜仲叶提取物、杜仲颗粒的主要化学成分组成基本一致＼[1819＼]，说明药材经过现代化工艺提取、浓缩等工艺制成颗粒后的主成分与药材提取物高度相关，提示杜仲颗粒保留了原料药中的主要特征成分，药效物质基础与药材保持一致。

2）采用标准煎液来标准化杜仲颗粒的质量，有助于实现临床用药的一致性和安全性。

3）本研究探索杜仲颗粒与其组方药味杜仲、杜仲叶的药用物质基础关系，体现了中药多成分作用整体性的质量控制方法。特征图谱专属性强、重复性好，可有效鉴别和评价杜仲颗粒的质量，全面体现杜仲颗粒的组成成分，共有峰归属的初步确立也为该产品的质量控制提供了依据，可为建立杜仲颗粒的综合质量标准提供一定的参考。

4）后期研究将进一步指认及明确杜仲颗粒中多种成分的含量及其药理作用。

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收稿日期：2019521;修回日期：20191021;责任编辑：张士莹

基金项目：河北省科技计划项目（16272511）

第一作者简介：马永青（1978—），女，河北石家庄人，副主任药师，博士，主要从事药物分析及质量控制方面的研究。

通讯作者：刘永利主任药师。Email：liuyongli2008@126.com

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