甜菜分子标记InDel-PCR引物的筛选

魏茜雅，刘乃新，吴则东，邳植，兴旺

（黑龙江大学现代农业与生态环境学院，哈尔滨150080）

0 引言

糖用甜菜是我国主要经济作物之一,是我国东北、西北、华北地区制糖的主要工业原料,在三北地区甜菜在农业产业结构调整和发展地方经济中占有重要地位。但由于中国不是甜菜起源国,缺少种质资源，再加之相关研究和资源积淀较薄,所以我国的甜菜研究水平整体落后。而随着基因组学研究的飞速发展,分子标记育种成为作物遗传改良的重要途径之一，新的分子标记不断被开发和广泛应用，从而加速了作物基因组辅助育种和设计育种的进程[1]。

甜菜分子标记技术近年来发展较快，已经有多种分子标记技术应用到甜菜的育种工作，如SSR[2]、ISSR[3-4]、AFLP[4-5]、RAPD[5]以及RFLP[6]等。InDel（Insertion-deletion）标记是基于同一物种不同个体基因组的同源序列发生核苷酸片段的插入或者缺失，也是通过对DNA同源序列比对产生空位的现象，根据基因组中插入缺失位点，设计一些扩增这些插入缺失位点的PCR-引物，其本质仍属于长度多态性遗传标记[7-8]。InDel作为一种高通量遗传标记，具有基因组内分布广泛、带型简单、重复性好、准确性高、变异稳定、密度高、数目众多等特点，与其他分子标记相比，在基因组的同一位置出现相同大小的InDel标记的概率非常低，避免了由于特异性和复杂性导致的后续分析模糊；在作物种质资源遗传多样性分析中，可显著提高其重现性、准确性和分辨率，因此能解决引种材料中名称混乱不清、种质资源整理困难、亲本材料间遗传重复度高等问题[7-9]；从分布密度看，InDel略低于SNP标记，却远高于SSR 标记[8]。该标记已应用于动植物的图位克隆、基因定位、遗传图谱的构建、群体遗传分析、种质资源分析与分子辅助遗传育种等。在水稻[10]、玉米[11]、棉花[12-13]、油菜[14]、绿豆[15]、番茄[16]、甜菜[17-18]和辣椒[9]等作物及果树[19]中得到了很好的应用。

目前甜菜InDel-PCR 引物报道的较少[17]，目前农业农村部甜菜质检中心已经利用甜菜重测序结合生物信息学技术开发了3 000多对InDel引物，我们从中合成了300 对InDel引物，通过对这300 对引物进行扩增、检测，筛选出适合于甜菜分子标记的InDel核心引物，并从中选择可以用于多重PCR 构建的引物，为InDel引物更好地在甜菜分子生物学上的利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试8个甜菜品种由糖料产业体系育种研究室提供，分别为：Beta240、Beta237、Beta379（美国Betaseed公司），MA3018、MA3005（丹麦Maribo公司），KWS3418、KWS2134、KWS2463（德国KWS公司），编号见表1。

表1 试验中用到的甜菜品种名称、编号及来源Table 1 Name,number and origin of sugar beet varieties used in tests

1.2 引物

试验中用到的300对InDel引物由农业农村部甜菜质检中心提供，按照ND1～300进行编号，所有引物均由上海生工生物工程公司合成，Hap纯化。

1.3 主要试剂及仪器

PCR 扩增所用的主要试剂dNTPs、Taq DNA 酶、10×Buffer、模板DNA、ddH2O。主要仪器有稳压稳流电泳仪（DYY-8B型）、DYCZ-30C型电泳槽、eppendorf PCR仪。

1.4 试验方法

1.4.1 甜菜基因组DNA的提取

试验中用到的甜菜品种首先在光照培养室中进行播种，取一对真叶展开期的甜菜幼苗基因组DNA，利用改良的CTAB 法[20]进行提取，用灭菌的纯净水进行溶解，经核酸蛋白测定仪检测浓度后，取部分稀释成10ng/µL的工作液，原液放入冰箱冷冻层进行保存。

1.4.2 扩增及检测

利用8个差异较大的甜菜基因组DNA 对合成的300对甜菜InDel引物进行筛选，所用的体系参考吴则东等人[21]的SSR反应体系，所用的PCR 程序中的退火温度均为55度，循环35次。反应结束后，利用银染法进行染色，拍照后进行数据统计，只统计条带清晰、易于识别并具有多态性的条带，分别记录每一对引物扩增的全部条带以及多态性条带。

表2 筛选出的甜菜InDel 引物及多态性条带数Table 2 The band number of primer and its polymorphism of InDel in sugar beet

2 结果与分析

2.1 甜菜InDel引物的筛选

利用300对InDel引物对8 个甜菜品种DNA 进行扩增，大部分InDel引物没有多态性或者条带不易识别。最终按照多态性较好、条带清晰、易于识别的标准，筛选出甜菜InDel引物44 对，筛选的引物名称、扩增总条带数、多态性条带数以及多态性百分比见表2。这44对引物共扩增出总条带116条，其中多态性条带109条，多态性比率为94%；44 对引物扩增的总条带数从2条到8 条不等，但以2 条为最多，为29 对，占总筛选出引物的66%；其中有37 对引物扩增的总条带为2 或3 条，可作为多重InDel 引物的首选。图1 为引物ND279、ND280及ND281扩增银染图。

图1 引物ND279、ND280及ND281扩增银染图Fig.1 Primer ND279,ND280 and ND281 amplified silver dyeing chart

2.2 多重InDel引物的确立

进一步确定InDel 多重引物。多重引物确立的一个标准就是不同引物扩增条带不能有重叠，因此条带太多很难构建成功多重PCR，因此最终确定总条带为2 条或者3 条的InDel 引物做为将来可以利用的多重InDel 引物。在筛选出的37 对引物中共筛选出了7 对引物可以构建一个四重、多个三重以及二重PCR，这7对引物按照扩增条带分子量从大到小排列顺序为：ND228、ND31、ND267、ND229、ND66、ND231、ND22。如图2 为可以建立三重InDel 的其中3 个引物：ND22、ND31、ND66，可以看到，这3 对引物扩增的条带没有重叠和交叉，且扩增的总条带数较少，适合于构建多重PCR。

图2 可以构建二重及三重PCR的3对引物Fig.2 Three pairs of primers constructed for double and triple PCR

3 结论与讨论

本文通过对300对甜菜InDel引物进行筛选，从中筛选出44 对可以用于甜菜分子标记利用的核心引物，这44 对引物共扩增出总条带116 条，其中多态性条带109 条，多态性比率为94%；其中有37 对引物扩增的总条带为2 或3 条，可以作为将来多重InDel 引物的首选；又从中筛选出7 对多重InDel 引物：ND228、ND31、ND267、ND229、ND66、ND231、ND22。甜菜InDel 引物的筛使得InDel 引物将来在甜菜分子生物学上的应用提供了可能，而多重Indel 引物的筛选也为高效地利用InDel 引物、减少药品的使用、提高效率提供了思路[22-23]。InDel分子标记在作物种质资源遗传多样性分析中有较好的重现性、准确性和分辨率，由于其分布广泛，因此需要花费更多的时间对其进行开发研究，以便筛选出更加合适的引物用于其分析鉴别研究[23]。

目前品种鉴定已经发展到分子阶段，用于构建品种指纹的DNA 分子标记应具有多态性高，重复性和稳定性好，带型清晰，易于识别统计，不容易受环境条件的影响等特点[16]。由于InDel引物的二态性标记特点，各引物仅两个等位基因且预期产物大小明确，对组建多重PCR 优势明显，能够保证引物充分扩增、避免其交叉，易于实现多重PCR，且InDel引物不会出现连续多峰现象，便于数据整理与统计分析[11]。但是二态性InDel标记在检测多倍体物种中，用一对引物不能实现该位点多种不同变异的检测，因此最终产生的二态性InDel标记组合需要覆盖整个基因组，才能保证品种鉴定的准确性[12]。InDel-PCR 扩增产物受多因素综合影响，若模板DNA 浓度较高，则会使抑制反应的成分增加而产生非特异性扩增；若模板DNA 浓度较低，则会使扩增产物条带残缺甚至不显现。而引物过高或过低的浓度对InDel-PCR 的带型也产生很大影响，要注意会产生形成引物二聚体或扩增不完全等现象。在提取DNA 之前的样品处理方法中，直接用研磨机打磨的方法，可以极大地提高样品研磨效率；而用锡箔研磨的样品损失小、DNA 无降解[24]。提取高纯度的模板DNA是进行InDel-PCR 的前提和基础，在甜菜样品基因组DNA 提取众多方法中，最常用的是CTAB 法，一般能满足各种要求，而SDS法成本较低，更适合甜菜叶片大量提取DNA，碱裂解法最适合快速检测[25]。本试验DNA提取方法是常用的CTAB法，该方法具有稳定性较好、得率较高、费用较低、操作步骤繁琐、耗时长，部分药品中毒性较大等特点；而DNA 提取试剂盒提取法具有操作较简单、纯度较高、杂质少、毒害较少、成本较高特点，高通量优质提取法在作物中逐渐被重视与应用[9，25]，今后应探讨该方法的应用效果，以期快速获得高质量的DNA、筛选出多重引物，更好地用于InDel标记遗传多样性分析。