凤梨内生菌筛选鉴定及拮抗效果评价

刘惠英，朱志强，陈嘉敏，罗美林，熊玉杰，易璐瑶，魏蜜

(1.湖北工程学院生命科学技术学院，特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室，湖北 孝感 432000；2.湖北大学生命科学学院，湖北 武汉 430062)

0 引言

凤梨(Ananascomosus)又名菠萝，属凤梨科(Bromeliaceae)凤梨属(Ananas)多年生草本果树植物，营养生长迅速，生产周期短，是世界重要的果树之一.在我国华南沿海一带分布广泛.作为热带地区特色水果，叶片细长的单子叶植物.不仅具有观赏价值，可作为室内常绿观赏花卉，还可以吸收污染物，从而作为空气污染指示植物[1].内生菌在植物中看起来微不足道，但内生菌可通过自身代谢物或通过信号传导对植物产生作用.有内生菌存在的植物一般比无内生菌植物生长迅速.一方面是：内生菌可分泌IAA、吲哚乙酸、激动素等促生长激素；另一方面是：增强植物对营养元素氮、磷、钾的吸收[2].在一株植物中，并非只有一种内生菌，众多的内生菌协调的存在于宿主体内，通过它们的共同作用，促进植物的生长[3].另外，内生菌之间也相互制约，一种内生菌可能会影响一种甚至多种内生菌在宿主植物中的生存，进而达到微环境的动态平衡[4].

本课题以凤梨为原料，对内生菌进行筛选和鉴定，通过平板对峙培养法筛选出3株对蔬菜软腐病菌菊迪基氏菌有拮抗效果的生防细菌，并通过形态学、生理生化和分子手段对其进行鉴定.评价了筛选的生防菌对常见细菌性病害和真菌病害的拮抗作用，并进一步评价了其解磷固氮和产纤维素酶能力，这对生防菌的选用及植物抗病促生提供了理论基础及参考，为拓展生物防治的微生物资源奠定了一定的基础.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试叶片 凤梨叶片于2018年10月采自湖北省孝感市孝南区卧龙乡凤梨种植基地.

1.1.2 供试菌株 病原细菌：蔬菜软腐病菌菊迪基氏菌DickeyachrysanthemiHBEU-9、胡萝卜果胶杆菌PectobacteriumcarotovorumZX-1、丁香假单胞菌PseudomonassyringaeG1、黄单胞菌XanthomonasarboricolaDW3F3.

病原真菌：燕麦镰孢菌FusariumavenaceumRot2、胶孢炭疽菌ColletotrichumgloeosporioidesPearE、互隔交链孢霉Alternariaalternatezzha.

以上所有菌株均由湖北工程学院特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室提供.

1.1.3 主要培养基 LB培养基[5]：NaCl 10 g，蛋白胨10 g，酵母粉5 g，琼脂18 g，加入蒸馏水定容至1 000 mL，pH 7.0～7.2；PDA培养基[5]：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，加蒸馏水定容至1 000 mL；PD则不加琼脂.

生理生化鉴定所需培养基：参照《常见细菌系统鉴定手册》[6].

PVK培养基：葡萄糖10 g，酵母浸膏0.5 g，NaCl 0.2 g，Ca3(PO4)25 g，(NH4)2SO40.5 g，KCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，FeSO4·7H2O 0.002 g，琼脂粉18 g，0.4%溴酚蓝(pH6.7)6 mL，加蒸馏水定容至1 000 mL；Asnby培养基：KH2PO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.2 g，CaCO35 g，甘露醇10.0 g，CaSO4·2H2O 0.1 g，琼脂18 g，加蒸馏水定容至1 000 mL；纤维素酶培养基：CMC 10 g，蛋白胨10 g，酵母粉10 g，NaCl 5 g，KH2PO41 g，琼脂18 g，加蒸馏水定容至1 000 mL，pH 7.0.

以上所有药品试剂均购于生工生物工程(上海)股份有限公司，马铃薯则购于孝感当地超市.

1.2 方法

1.2.1 凤梨拮抗内生菌的分离与筛选 将凤梨叶片洗净凉干后于超净工作台上进行表面消毒处理[7]：70%乙醇中浸泡2～3 s后，用0.1% 酸性升汞水溶液处理1～3 min，再用无菌水清洗3次.

对表面已消毒的材料采用研磨法[6]分离内生菌.所得研磨匀浆适当稀释，涂布于 LB、PDA平板上于28 ℃培养2～7 d.待长出菌落后采用培养皿稀释培养法[7]和平板划线分离法[7]进行内生菌的分离纯化，直到得到单菌落，然后将菌落形态特征不同的单菌落分别挑取并及时分离编号，4 ℃保存备用.

初筛：采用点接法[6]进行初步筛选.量取100 μLD.chrysanthemiHBEU-9病原细菌发酵液，在LB平板上进行涂布，待干燥后用接种针分别挑取各内生菌点于平板上，每皿采用十字交叉法点接一种内生菌，对照不接种，30 ℃下培养3～7 d，观察有无抑菌圈及抑菌圈直径，测量抑菌圈直径.

复筛：采用发酵液打孔法[6]进行再次筛选.量取100 μLD.chrysanthemiHBEU-9病原细菌发酵液，在LB平板上进行涂布，待干燥后采用十字交叉法在平板上打4个对称的4 mm小孔，每孔接种20 μL的内生菌发酵液，对照不接种，30 ℃下培养3～7 d，观察有无抑菌圈及抑菌圈直径，测量抑菌圈的直径.

1.2.2 凤梨内生菌的鉴定

1)形态学鉴定.菌落形态观察[6]：将内生菌发酵液稀释涂布于LB平板上30 ℃培养24 h，观察菌落生长情况、颜色和大小、性状、边缘、表面、透明度等.

革兰氏染色[6]：参照Hucker修改法[5]对获得的内生菌进行革兰氏染色，显微镜下观察染色结果，判断其为革兰氏阳性或阴性菌.

2)分子生物学鉴定.参考左山等[8]的分子生物学实验方法，进行内生菌菌株DNA提取，使用引物F27(AGAGTTTGA-TCCTGGCTCAG)和R1492(TACGGCTACC-TTGTTACGACTT)进行PCR扩增.反应条件为：在94 ℃变性4 min；94 ℃变性30 s；然后55 ℃进行退火30 s，72 ℃进行延伸1 min，一共34个循环；最后在72 ℃下进行延伸10 min.得到的产物通过琼脂糖凝胶电泳检测后，送天一辉远有限公司测序，得到测序结果后在NCBI网站上经过BLAST同源性比较，使用MEGA6.0构建系统发育树.

1.2.3 拮抗效果测定 内生菌发酵液制备[7]：取1%接种量把内生菌F-2、F-3-1、F-3-2分别接种于LB液体培养基，在180 r/min，30 ℃条件下摇床培养12～18 h.

抑制病原细菌拮抗效果测定[9]：采用平板对峙法[5]，在无菌超净工作台上，取病原细菌D.chrysanthemiHBEU-9、P.syringaeG1、X.arboricolaDW3F3、P.carotovorumZX-1发酵液100 μL在LB平板上涂布，内生菌接种方法参照对内生菌的筛选实验，对照不接种，30 ℃下培养3～7 d，每隔12 h观察是否产生抑菌圈，测量并记录抑菌直径.

抑制病原真菌拮抗效果测定[10]：采用平板对抗法[5]，在无菌超净工作台上，将病原菌F.avenaceumRot2、C.gloeosporioidesPearE、A.alternatezzha菌块用打孔器接种于PDA培养基中央，内生菌接种方法参照对病原细菌的拮抗实验，对照不接种，28 ℃条件下培养3～7 d，测量各筛选的内生菌菌落边缘与病原真菌菌落边缘的抑菌圈并记录.

1.2.4 部分生化指标鉴定 生理生化鉴定参照《伯杰细菌鉴定手册》[11]和《常见细菌系统鉴定手册》[6]进行.

溶磷能力测定：分别在PVK培养基上点接所得内生菌，于30 ℃培养，每隔12 h观察一次，待出现解磷圈及时记录.

固氮能力测定：分别在Asnby培养基上采用划线法接种所得内生菌，于30 ℃培养，每隔12 h观察一次，记录菌株的生长状况.

产纤维素酶能力测定：分别于纤维素酶培养基上点接所得内生菌，于30 ℃培养，每隔12 h观察记录平板上菌落的生长情况.

2 结果与分析

2.1 凤梨拮抗内生菌的分离与筛选将分离到的内生菌进行拮抗效果筛选.根据所获得的菌株与病原菌进行平板对峙分析，结果表明有3株内生细菌对以上4种病原细菌和3种病原真菌均有一定的抑制效果，将其编号为F-2、F-3-1、F-3-2.但本实验未筛选到对上述病原细菌和真菌有抑制效果的内生真菌.

2.2 凤梨内生菌的鉴定

2.2.1 形态学鉴定 如图1所示，通过观察发现3株内生细菌菌体呈杆状，F-2和F-3-2芽胞为椭圆形到柱状，F-3-1芽胞呈椭圆状.3株内生菌幼龄菌落均为圆形，表面及边缘较为光滑，均呈白色，培养24 h后菌落表面变得干燥且起皱，但边缘仍保持光滑，菌落颜色也任然为白色.通过革兰氏染色，显微观察3株菌均为紫色，故为3株内生菌均为革兰氏阳性菌.

图1 各菌株菌落及显微形态

2.2.2 分子生物学鉴定 3株内生菌16S rDNA区域经过PCR扩增产物，均获得了1 445 bp左右的碱基序列，在GenBank数据库中均能找到同源性很高的相似菌株序列.使用MEGA6.0对3株内生菌进行同源性分析，同时构建系统发育树.发现F-2与Bacillusamyloliquefaciensstrain 13(登录号HM1070806.1)菌株序列相似度为95%(如图2)，确定F-2菌株为解淀粉芽胞杆菌(B.amyloliquefaciens).F-3-1与Bacillusmegateriumstrain NBRC 15308(T)(登录号MK424276.1)菌株序列相似度为97%(如图3)，确定F-3-1菌株为巨大芽胞杆菌(B.megaterium).F-3-2与Bacillussubtilisstrain JCM 1465(登录号MH145363.1)菌株序列相似度为94%(如图4)，确定F-3-2菌株为枯草芽胞杆菌(B.subtilis).

图3 内生菌F-3-1基因序列构建的系统发育树

图4 内生菌F-3-2基因序列构建的系统发育树

2.3 拮抗效果测定3株目标内生菌与8株病原菌拮抗实验表明，F-2对病原细菌D.chrysanthemiHBEU-9、P.syringaeG1、X.arboricolaDW3F3、P.carotovorumZX-1均有不错的拮抗效果，尤其对P.syringaeG1的抑菌直径达到28.83 mm，但是F-2对3株供试病原真菌均无明显拮抗作用(如图5，图6)；F-3-1对病原真菌F.avenaceumRot2、C.gloeosporioidesPearE、A.alternatezzhazzha均有极强的抑制作用，抑菌率分别为：70.83%、91.67%、65.56%(如表1)，仅对病原细菌D.chrysanthemiHBEU-9、P.syringaeG1、X.arboricolaDW3F3有拮抗效果，抑菌直径平均为13.25 mm左右(如图6)；F-3-2对病原真菌的拮抗效果远不如F-3-1，且仅对C.gloeosporioidesPearE、A.alternatezzhazzha有抑制作用，抑菌率为31.67%、23.88%，其对病原细菌的拮抗效果强于F-3-1，对X.arboricolaDW3F3、P.carotovorumZX-1的抑菌直径分别为20.70 mm、13.33 mm均高于F-2，而对D.chrysanthemiHBEU-9、P.syringaeG1的抑制效果则低于F-2(如表2).即F-3-1表现出对多种病原真菌极强的抑制效果，可以开发为真菌的生防菌.F-2与F-3-2对真菌抑制效果较差，但对多种病原细菌表现出拮抗效果.可见不同的菌株的抗菌谱存在显著差异.在利用内生菌进行生物防治时可以有针对性的使用一种或多种菌联用来达到抗病害的效果.

表1 各菌株与不同病原真菌的抑菌率 %

表2 各菌株对病原细菌的抑菌直径 mm

表中抑菌直径小于5.00 mm的均记为0.00 mm

图5 内生菌 F-3-1对各病原真菌的拮抗效果

图6 3株内生菌对各病原细菌的拮抗效果

2.4 内生菌部分促生能力测定

2.4.1 内生菌解磷能力测定 分离的3株内生菌点接于PVK平板上，观察解磷圈.从图7可知，F-2、F-3-1、F-3-2均具有解磷能力，且F-2的解磷能力强于后者.说明F-2从磷酸三钙中释放游离磷酸的能力更强，能更好地利用环境中的磷元素.

图7 3株内生菌在PVK培养基上的生长情况

2.4.2 内生菌固氮能力测定 将所得的3株内生菌接种在Asnby培养基(无氮)上，通过观察其能否在无氮源的环境中生长，来测定其是否具有固氮能力.实验结果如图8所示，F-2无固氮能力，F-3-1、F-3-2均能在无氮源培养基上生长，说明其具有固氮能力.

图8 3株内生菌在Asnby培养基(无氮)上的生长情况

2.4.3 内生菌产纤维素酶能力测定 在纤维素酶培养基上点接获得的内生菌，观察透明圈，即可判断3株内生菌能否产生纤维素酶，实验结果如图9所示.3株内生菌都能产生透明圈，F-2、F-3-1、F-3-2均可以生成纤维素酶，并能分解纤维素.但从透明圈的大小判断F-2和F-3-2的纤维素酶活性高于F-3-1.

图9 各菌株在纤维素酶培养基上的生长情况

3 结论与讨论

本课题探究了凤梨内生菌对常见病原菌的生防效果，并从生理生化层面、形态学层面、分子生物学层面对所获得3株内生菌进行鉴定.通过细菌真菌筛选方法，从凤梨中筛选出18株内生菌，通过平板对峙最终得到3株优良内生菌，分子生物学鉴定3株菌分别为BacillusamyloliquefaciensF-2，BacillusmegateriumF-3-1，BacillussubtilisF-3-2.为了明确其生防效果，又进一步进行了抑菌直径的观察，发现F-2和F-3-2对常见病原细菌有不错的拮抗效果抑菌直径平均为10 mm以上，F-3-1对常见病原真菌有极强的拮抗效果，平均抑菌率为76 %.同时，为了探究内生菌促进植物生长的特性，采用筛选培养基对3株内生菌进行溶磷固氮及产酶分析，结果发现3株菌解磷，产纤维素酶能力较好，F-3-1和F-3-2具有较好的固氮能力.

参考协同演化(co-evolution)理论，内生菌中内生真菌能与宿主植物建立更稳定的长期共生关系，因而，内生真菌资源的发掘利用有待探索[12].从防治凤梨黑斑病出发，本实验获得了具有高效防治效果的3株内生细菌不仅可以促进宿主植物抗病害能力，更能通过改善生长环境中的磷源促进植物生长.内生菌区别于普通拮抗菌，具有更大的利用潜力.虽然对内生菌的多个指标进行了测定，但是缺乏对这3株芽胞杆菌的深层抗菌基因簇的研究，鉴定获得的内生菌为芽胞杆菌，我们查阅文献发现，芽胞杆菌已发现的抑菌物质包括：丰源素、伊枯草素等非核糖体途径产生的脂肽类抗生素[13]，以及核糖体途径产生的脂肽类如类羊毛硫抗生素等，脂肽类物质是芽胞杆菌的主要抗菌物质，其表现为较强的抗真菌和极弱的抗细菌效果[14]，另芽胞杆菌可分泌聚酮类物质亦有抗菌作用，研究表明聚酮针对细菌有很强的抑制作用[15-16]，结合我们的内生菌F-3-1主要拮抗病原真菌的特性，推测其抗菌活性和脂肽类物质有关；F-2和F-3-2的拮抗细菌作用与聚酮类物质有关.因此对内生菌的研究还有待深入，进一步明确其基因层面抗菌机理.