Al3＋和Cr6＋对菊芋多酚氧化酶同工酶的酶活影响

黎军

【摘 要】本文论述采用聚丙烯酰胺电泳法（PAGE），以 T=7.5%，T=10%，T=13%，T=15% 四种浓度不同的凝胶系统分离经 Al3+ 和 Cr6+ 处理过的菊芋中的多酚氧化酶（PPO）同工酶进行的实验，用两种染色配方进行染色比较，并进行酶谱分析，得到的结果表明：（1）在 T=10% 凝胶系统中菊芋 PPO 同工酶分离效果最好，共有10条酶带;（2）在两种染色液配方中，配方一的染色效果较好;（3）经 Al3+ 处理过的菊芋中的多酚氧化酶（PPO）同工酶的酶活比没有处理过的菊芋中的多酚氧化酶（PPO）同工酶的酶活性低，说明 Al3+ 对菊芋中的多酚氧化酶（PPO）同工酶的活性有抑制作用;（4）经 Cr6+ 处理过的菊芋中的多酚氧化酶（PPO）同工酶的酶活与没有处理过的菊芋中的多酚氧化酶（PPO）同工酶的酶活相差不大，说明 Cr6+ 对菊芋中的多酚氧化酶（PPO）同工酶的活性抑制不明显。

【关键词】菊芋 聚丙烯酰胺电泳法 多酚氧化酶同工酶  Al3+ Cr6+

【中图分类号】G  【文献标识码】A

【文章编号】0450-9889（2020）38-0039-03

菊芋，别名鬼子姜、洋姜，菊科（compositae）向日葵属植物，能形成地下块茎的多年生草本植物，学名heianthustuberosusl，染色体数 2N=102，六倍体物种。原产北美洲，经欧洲传入我国。现我国大多数地区都栽培种植，是一种抗旱、抗风沙、耐寒、无病虫害、抗逆性强并具有广泛适应性的物种，植株高 1—3 米，根系发达，具有再生性强等特点。据相关资料报道，菊芋可用于治理沙漠但未广泛应用。菊芋能成为沙漠之星与它的生长特性有关，而它的生长特性与菊芋植物体内的酶系统有关。目前未见有太多关于菊芋多酚氧化酶（Polyphenol Oxidase，简称 PPO）同工酶研究资料的报道。本文运用聚丙烯酰胺电泳及活性染色方法，对菊芋中的多酚氧化酶（PPO）同工酶酶谱进行分析，为寻找与菊芋特殊生命力有关的酶提供基础资料，并为菊芋能作为治理干旱地区的植物之一提供一些生理化指标。

一、材料与试剂

（一）材料

实验材料：菊芋。

菊芋的预处理：种植 14 盆菊芋幼苗，每 2 盆作为 1 个编号，分别编号 1，2，3，4，5，6，7。其中，1 号为对照，只浇清水，不用作其他任何处理。用 Al2（SO4）3 分别配成浓度为 50 umol/L，100 umol/L，200 umol/L 的溶液各适量，分别浇在 2，3，4 号植株中，每次各 50 ml，每隔 3 天浇一次，共要浇 4 次。用 K2Cr2O7 分别配成浓度为 50umol/L，100umol/L，200 umol/L 的溶液各适量，分别浇在 5，6，7 号植株中，每次各 50 ml，每隔 3 天浇一次，共要浇 4 次。

（二）药品

丙烯酰胺（Acr，广州医药站化学试剂公司），N N 一甲双叉丙烯酰胺（Bis，Fluka），过硫酸胺（Ag，广东汕头新宁华工厂），三羟基甲基氨基甲烷（Tris，成都化学试剂厂），氨基乙酸（Gly，广东汕头新宁华工厂），四甲基乙二胺（TEMED，东京化成工业株式会社），分析纯盐酸。

染色药品：邻苯二胺（O—phen，上海试剂总厂第三分厂），对苯二胺（P—phen，上海五联化工厂），邻苯二酚（Pyro，上海试剂总厂第三分厂），草酸（Dxal，广东汕头西陇化工厂），蔗糖（Sucr，广州化学试剂厂），磷酸氢二钠（Diso，广东汕头西陇化工厂），磷酸二氢钠（上海新华化工厂）。

（三）仪器

离心机（TGL—16 型，上海医疗机器六厂），电泳仪（702B型上海市医药公司）。

二、方法

（一）酶液的提取

称取菊芋成熟叶子 200mg，置于预冷的小研钵中，加 0.05mol/L Tris-HCL（PH=8.0）提取缓冲液 1 ml，在冰浴中研磨成匀浆，然后冷冻离心（12000/min）20 min，弃沉淀，收集上清液为粗酶液并滴加 10% 蔗糖溶液 2 滴保存于冰箱中备用。

（二）凝胶的制备

制备聚丙烯酰胺凝胶。凝胶配制系统，如表 1 所示（见下页）。

（三）加样

用微量进样器上样。菊芋 PPO 同工酶用 T=10% 膠浓度进行电泳，每管上样量为 60ul。电泳上样前在酶液中加入 1 滴 0.1% 溴酚蓝，混匀后上样。

（四）电泳

开始电泳时采用稳压 49V，25 分钟后，电压加大为 149V，电泳在常温下进行，时间约需 2.5 小时。

（五）染色

当样品从（-）电泳到距（+）还有大概 1 厘米的时候，用注射器吸取蒸馏水注射到玻璃管中使凝胶从玻璃管中滑出，分别放到干净试管中，然后现配染色液。配染色液采用的染色配方有两种：

配方一：按 0.06% 对苯二胺（用适量 0.01M 草酸溶解后再加蒸馏水混合）∶1% 邻苯二酚∶0.05M 磷酸缓冲液（PH=6.8）=1∶6∶1（V/V）配制，将配好的染色液加入各个试管中（染色液要浸过凝胶），待染色 15—20 分钟后观察酶带的出现情况，待酶带较为清晰的时候倒去染色液，加 2% 的醋酸浸泡，保存，拍照。

配方二：按 0.06% 邻苯二胺（用适量 0.01M 草酸溶解后再加蒸馅水混合）：1% 邻苯二酚：0.05M 磷酸缓冲液（PH=6.8）=1∶6∶1（V/V）配制，将配好的染色液加入各个试管中（染色液要浸过凝胶），待染色 15—20 分钟后观察酶带的出现情况，待酶带较为清晰的时候倒去染色液，加 2% 的醋酸浸泡，保存，拍照。

（六）Al3+，Cr6+ 对菊芋处理后的菊芋 PPO 同工酶酶活性的测定

方法：以 50 m mol/L 的邻苯二酚（磷酸缓冲液，pH=6.5）为底物，加入适量的酶液，作用 5 分钟后测产物在 420 nm处的吸光度，直接用吸光度表示酶活大小。

步骤：3 ml 酶液+5ul 显色剂（邻苯二酚），5 分钟后测得A420 的值。

三、结果与分析

（一）菊芋 PPO 在不同凝胶浓度中和在不同染色配方中的电泳图谱

1.菊芋 PPO 同工酶酶谱如图 1 所示，在 T=7.5%，T=10%，T=13%，T=15% 四种不同胶浓度中分别见到 9，10，8，7条 PPO 同工酶酶带。在 T=15% 分离胶中仅见 7 条 PPO 同工酶酶带，说明胶孔隙太小不能使分子量相近、形状相似的同工酶分开。在 T=13% 中胶孔隙比在 T=15% 稍大，见到 8 条 PPO 同工酶酶带，比 T=15% 胶多一条带，在 T=7.5% 胶孔隙比在 T=13% 更大，见到 9 条 PPO 同工酶带，比 T=15% 和 T=13% 分别多 2 条、1 条。而在 T=10% 中见到 PPO 同工酶酶带有 10 条，可知在此浓度中 PPO 同工酶酶带分辨率最高，分离效果最好。

2.在图 1 中，Al，Bl，Cl，Dl 用的染色配方为染色配方一，染出带数为 9，10，8，7。在 A2，B2，C2，D2 中，染色配方为染色配方二，染出带数为 9，10，8，7。第二种染色配方相比于第一种染色配方，其染色酶带清晰度低于第一种染色配方，可见第一种染色配方的染色效果较好。

（二）不同上样量的菊芋 PPO 电泳图谱

不同上样量的菊芋 PPO 电泳图谱如图 2 所示，其中 A，B，C 上样量分别为 50ul，60ul，70ul，经染色后 A 有 9 条酶带，B 和 C 各有 10 条酶带，但其中 B 的酶带比 C 中的酶带较清晰，可知 60ul 的上样量使酶带分辨率更高，分离效果更好。

（三）Al3+，Cr6+ 对菊芋 PPO 同工酶酶活性的影响

由 Al3+，Cr6+ 对菊芋处理后的菊芋 PPO 同工酶酶活性的测定方法测得结果如表 2 所示（见下页）。

由表 2 的数据可知，受处理过的 2，3，4 号的 PPO 同工酶的酶活受到 Al3+ 的影响酶活明显下降;受处理过的 5，6，7 号的 PPO 同工酶的酶活受到 Cr6+ 的影响酶活变化不是很明显。

（四）Al3+，Cr6+ 对菊芋中 PPO 同工酶电泳图谱的影响

1.由图 3 可以知道：（1）当菊芋经 Al3+ 处理过后，它的电泳图谱对照 1 号为 10 条酶带;2，3，4 号的酶带数分别为 9 条、8 条、7 条;2 号样比 1 号样少第 P7 条带，3 号样比 1 号样少第 P4 和 P7 两条带，4 号样比 1 号样少第 P4、P6、P7 三条带，带数是呈递减趋势，酶带颜色也逐渐变浅，酶带粗度相对变小。原因可能是随着 A13+ 的加入和濃度的增加，菊芋中的 PPO 及其同工酶的酶活性明显降低，同时说明，Al3+ 对菊芋的生长影响较大。如果菊芋在生长环境中大量吸收 Al3+，那么 Al3+ 会抑制 PPO 及其同工酶的活性，极大降低菊芋的抗病性，不利于菊芋的生长。

2.菊芋经 Cr6+ 处理过后，它的电泳图谱 5，6，7 号的酶带数分别为 9，10，9;5 号样比 1 号样少第 P7 条带，7 号样比 1 号样少第 P7 条带，带数变化不大，酶带颜色变化不大，酶带粗度相差也不大。这表明 Cr6+ 对菊芋的 PPO 及其同工酶的活性影响不是太明显，但大量吸收也会破坏菊芋 PPO 及其同工酶的抗病性，不利菊芋的生长。

3.第 P7 条带受 Al3+ 和 Cr6+ 的影响最大，其敏感性最强。其次为 P4 和 P6 两条带。

4.在七个样品中，它们的 Pl、P2、P3 三条带的颜色最深，说明它们的酶活力最大。

四、结论与讨论

同工酶是指生物体内催化相同反应，但分子结构不同的一组酶。同工酶（蛋白质）在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率不同，能反映它们在分子大小上的差异。大多数基因性同工酶（由不同基因产生的肽链而衍生的同工酶）常表现不同的生理功能。同工酶既可以作为生理指标，又可以作为可靠的遗传指标。我们可以根据同工酶谱的变化，来鉴别生物类别及其亲缘关系。在生物学中，同工酶可用于研究组织分化、个体发育、遗传变异、物种进化、杂交育种等。

多酚氧化酶（PPO）是儿茶酚氧化酶和漆酶的统称，是自然界分布极广的一种金属蛋白酶，也是一类氧化还原酶。普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。目前科研人员已对多酚氧化酶与生物体抗病性之间的关系进行了大量的研究。植物中的多酚氧化酶能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌类化合物，进而发挥抗菌和驱赶捕食者的作用。

聚丙烯酰胺凝胶电泳是让所分离的物质带上负电，然后根据所带的负电荷数的不同、分子量大小的不同、分子形状的不同，以及分子通过三维网状结构的聚丙烯酰胺凝胶时因迁移率的不同从而分离出同工酶。凝胶浓度的大小、pH 的大小、电极缓冲液离子强度的高低都会对分离结果造成一定的影响，使电泳结果产生或多或少的误差。通过反复电泳实验探究和实验结果验证，需注意以下几方面：（1）凝胶贮液使用前应过滤 1～2 次，便于除去药品中的杂质。（2）凝胶贮液从冰箱中取出，应过 20 分钟以后再用，可以避免因热胀冷缩而在凝胶柱中形成气泡，影响实验结果。（3）电泳时间应控制在 2～3 小时之间，时间过长，玻璃管发热，酶带扩散，出现拖尾。（4）PPO 宜在 149V～200V 低压电泳，电压过高，电泳时间过短，不利于分子量相近的同工酶分离。

在 T=7.5%，T=10%，T=13%，T=15% 四种不同凝胶系统中，T=10% 的凝胶系统最适合菊芋中多酚氧化酶（PPO）同工酶的分离，其分离结果最清晰，效果最好。

在 T=10% 的凝胶系统中，上样量为 60 ul 的分离效果最好，酶带最为清晰。

在两种染色配方中，配方一的染色效果比配方二清晰。

经过 Al3+ 处理过的菊芋中的 PPO 同工酶活性明显受到抑制，而经过 Cr6+ 处理过的菊芋中的 PPO 同工酶活性影响不明显。其中，第 P7 条带受 Al3+ 和 Cr6+ 的影响最大，敏感性最强，其次为 P4 和 P6 两条带。在七个样品中，它们的 P1，P2，P3 三条带的颜色最深，说明它们的酶活力最大。

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（责编 卢建龙）