改性石墨烯包覆光纤的马赫-曾德尔大肠杆菌传感器

彭志清，廖 杰, 李玉洁，冯文林*，杨晓占

(1.重庆理工大学 理学院 物理与能源系, 重庆 400054;2.绿色能源材料技术与系统重庆市重点实验室, 重庆 400054;3.中山大学附属第六医院, 广东 广州 510665)

1 引 言

近年来，食品安全问题备受关注。其中，食源性细菌严重影响现代人的健康，有人甚至被夺去生命。大肠杆菌是一种常见的食源性病原体，全球每年有百万人受它影响，特别是肠出血型大肠杆菌，感染后会引起腹痛和腹泻等，甚至危及生命[1]。传统的食源性致病菌检测方法相对准确且成本低廉，但是耗时费力，可能错失控制食源性疾病的最佳预防和治疗时间[2]。因此，免疫学检测技术、分子生物学技术等快速检测方法被提出，但这些检测方法通常需要特定的检测仪器和专业人员，而且其灵敏性和响应时间仍需要改进[3]。光纤传感器具有测量精度高、反应灵敏等优点，在生物医学、食品安全、环境监测等领域得到广泛的应用[4]。将选择性强的敏感材料涂覆于合适的光纤传感结构，是解决大肠杆菌快速、灵敏检测的有效方法之一。

在敏感材料中，石墨烯是由碳原子以sp2杂化轨道组成的六角蜂巢结构的二维碳纳米材料，具有优异的物理化学性能，而且对石墨烯进行改性后可赋予它一些额外的特性。目前，国内外对石墨烯生物传感器进行了广泛研究[5]，基于石墨烯的传感器主要是利用其高比表面积及优异的导电性等。2018年，Thakur等人使用基于超薄Al2O3层钝化的还原氧化石墨烯场效应晶体管，实时检测大肠杆菌，该传感器对大肠杆菌具有响应快速和选择性高等优点，但其循环使用性能有待提高[6]。2019年，Gupta等人利用铜金属有机框架材料与聚苯胺复合，制成电化学生物传感器，该传感器可在一定的响应时间(约2 min)内实现对极低浓度大肠杆菌(2 cfu/mL)的高灵敏检测[7]。

基于此，本文设计了一种基于马赫-曾德尔干涉原理的光纤大肠杆菌传感器，并在感测区的光纤表面镀上一层改性石墨烯敏感膜。当光纤表面的敏感膜特异吸附大肠杆菌后，感测区光纤包层的有效折射率发生改变，在光谱仪上可观察到干涉图谱的偏移[8-9]，从而将大肠杆菌的浓度信息与光干涉信息联系起来。该全光纤结构传感器具有制作工艺简单、稳定性好、响应快速和抗干扰能力强等优点，可实现对病原体的高效快速检测。

2 基本原理

2.1 传感机理

刀豆凝集素(Con A)是一种豆科植物凝集素，与以α-1，2糖苷键连接的甘露二糖和甘露三糖有最大的亲和力，能与细胞膜糖蛋白的葡萄糖部分特异结合[10]。而大肠杆菌的细胞膜中的脂多糖恰好可以作为特异结合Con A的靶点。基于此，本文设计并构建了能特异结合大肠杆菌的光纤生物传感器。

结合1-氨基芘(1-Apy)表面的氨基(-NH2)和麦芽糖表面的羰基(C=O)，使两者以Schiff′s base反应偶联，得到产物为Mal-Apy。又因1-Apy中芘环良好的平面结构，易在石墨烯表面发生π-堆积自组装，进而稳定结合光纤表面的石墨烯[10]。而复合材料中的麦芽糖可与Con A高效结合，使Con A稳定附着在光纤表面，用于特异性识别大肠杆菌。

2.2 传感光学原理

图1为光纤传感实验装置示意图，将传感光纤固定在水槽中，插图为传感区结构示意图。光子晶体光纤(Photonic Crystal Fiber, PCF)与标准单模光纤进行双粗锥熔接，形成粗锥型马赫-曾德尔干涉结构。一束光进入第一段单模光纤后，经过第一个粗锥熔接点被分为两部分，一部分光继续在纤芯内传输，另一部分光进入PCF的包层中，在第二个熔接点两部分光汇聚。由于两部分光经过的路径和介质不同，光在第二段单模光纤汇聚传输时存在光程差，因此产生干涉[11-13]。

图1 光纤传感实验装置示意图Fig.1 Schematic diagram of optical sensing experimental setup

传感器的传输强度定义为[14-15]：

(1)

其中：I1和I2分别为纤芯和包层模的强度；Δφ为模间相位差，表达式如下：

(2)

式中λ为入射光的波长；L为感测区长度；Δneff=ncore-ncladding，为纤芯和包层的有效折射率差。

在PCF的包层表面涂覆敏感膜，当它吸附待测物时，包层的有效折射率发生变化，而纤芯的折射率不变，因此干涉波谷将发生变化，其m阶波谷变化量表示为：

λ=[2(Δneff+Δn)L-2ΔneffL]/(2m+1)=

2ΔnL/(2m+1).

(3)

由式(3)可以看出：当包层有效折射率变大时，(Δneff+Δn)减小，即Δn变为负值，干涉波谷向短波长方向移动，即光谱发生蓝移。

测试时，将不同浓度的大肠杆菌加入水槽中，在光谱仪上可观察到不同波长的干涉情况。因光子晶体光纤表面涂覆了偶联Con A的改性石墨烯敏感膜，并结合粗锥型光纤马赫-曾德尔干涉原理，可通过对光谱的检测实现对大肠杆菌的特异快速检测。

3 敏感材料的制备与表征

3.1 试剂与仪器

实验中使用的实心光子晶体光纤由武汉长飞光纤光缆有限公司生产；石墨烯量子点(厚度：1～6 nm；横向尺寸<10 nm)由南京先丰纳米材料科技有限公司生产；1-Apy(AR, 97%)由Acros公司生产；麦芽糖(AR, 97%)和氰基硼氢化钠(AR, 95%)由上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供；大肠杆菌由陆军军医大学培养提供；激光光源为康冠ASE宽带光源；光谱分析仪为日本横河AQ6370D型光谱分析仪；拉锥熔接机为古河S178C光纤熔接机。实验用水均为Molecular制造的超纯净水 (18.25 MΩ· cm)。

3.2 改性石墨烯材料制备

首先，取12 mL体积比为1∶1的磷酸盐缓冲液(PBS)和甲醇的混合液，加入100 μmol麦芽糖和150 μmol 1-Apy，溶解后静置1 h；然后加入300 μmol氰基硼氢化钠后密封，80 ℃的磁力搅拌48 h，对得到的混悬液进行抽滤洗涤，得到绿色粉末；将粉末用5 mL乙醇均匀分散后，加入10 mL的PBS缓冲液超声15 min，确保粉末均匀分散，然后再加入2 mL的石墨烯量子点后继续超声15 min，得到绿色溶液，于4 ℃保存。镀膜前，取2 mL上述溶液于小烧杯中，加入0.002 μmol的刀豆凝聚素A，低温超声15 min后即可得到需要的复合材料溶液[15]。实验中，为使Mal-Apy材料能够更好地包覆在光纤上，加入石墨烯量子点。

3.3 石墨烯复合膜涂覆光子晶体光纤制备

用全自动光纤熔接机将光子晶体光纤的两端与两根标准单模光纤进行粗锥熔接，形成基于SMF-PCF-SMF的光纤马赫-曾德尔干涉传感结构。在光子晶体光纤的包层上涂敷一层石墨烯复合膜的制备工艺主要为：取上述制备的复合材料溶液进行超声15 min后，将传感结构中的光子晶体光纤置于载玻片上，在光纤周围均匀滴加复合材料溶液并充分浸涂10 min，使光子晶体光纤表面形成一层改性石墨烯复合膜，重复3～6次，直至在显微镜下观察到光纤表面有一层淡黄色的涂层。再将其放入冷冻干燥机中充分干燥，使敏感材料与光纤之间稳定黏附。

3.4 复合材料的表征

复合材料的X射线能谱分析采用赛默飞世尔科技(荷兰)有限公司生产的FEI Talos F200S型场发射透射电子显微镜进行测试。材料的傅里叶红外光谱借助赛默飞世尔科技(中国)有限公司生产的Nicolet iS50型傅里叶变换红外光谱仪进行测试。拉曼光谱仪采用法国Jobin Yvon S.A.S公司生产的LabRAM HR Evolution型显微共聚焦拉曼光谱仪。

4 实验结果与讨论

4.1 复合材料的表征分析

4.1.1 X射线能谱分析

光纤表面复合膜的X射线能谱分析结果如图2所示。图2表明，该样品主要含有N，O，Na，P，K，Cu和Ca元素，图2(a)和2(b)分别为C元素和N元素分布图，其中C元素主要来源于石墨烯量子点，较强的N元素主要来源于1-Apy中的氨基和Con A的组成成分氨基酸，O元素主要来源于刀豆素与麦芽糖，Na，P，K主要来源为氰基硼氢化钠和PBS缓冲液，少量的Cu和Ca为杂质。能谱分析结果初步表明，Con A结合到了光子晶体光纤表面。

图2 改性石墨烯材料的能谱分析Fig.2 Energy spectrum analysis of modified graphene

4.1.2 傅里叶变换红外光谱分析

图3是复合膜的傅里叶变换红外光谱图。图3中，1 070.09 cm-1处的峰属于直链C-C伸缩振动，归属于Con A中氨基酸的C-C键；958.51 cm-1处的峰属于CN-O的伸缩振动，原因是在材料制备过程中部分氨基被氧化；1 249.97 cm-1处的峰属于NO3的反对称伸缩振动，由氨基被氧化所导致；当氮氢的振动频率为1 560～1 535 cm-1时，该振动模式属于仲酰胺振动，该峰为NH面内弯曲振动和CN伸缩振动耦合的结果，主要是NH的面内变角振动，因此1 538.54 cm-1处的峰属于氨基的一个特征峰；833.22 cm-1处的宽峰属于氨基中的NH2扭曲振动特征峰；737.68 cm-1处的峰也属于氨基中NH的面外弯曲振动特征峰[16-19]。分析结果进一步证实，敏感膜中确含有Con A。

图3 改性石墨烯材料的傅里叶红外光谱分析Fig.3 Fourier infrared spectrum of modified graphene material

图4 改性石墨烯材料的拉曼光谱分析Fig.4 Raman spectroscopy analysis of the modified graphene material

4.1.3 拉曼光谱分析

敏感膜的拉曼光谱测试结果如图4所示。其中1 011，1 210，1 215 cm，1 404 cm-1等峰都与α-丙氨酸相近，1 011，1 407 cm-1等峰都与β-丙氨酸相近，540，1 050，1 404 cm，1 618 cm-1等峰都与6-氨基己酸相近，1 050，1 320，1 404，1 585，1 618 cm-1等峰都与甘氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等氨基酸相近[20-23]。综合上述分析结果，确认了氨基酸的存在，证明了该样品中含有Con A。

4.2 大肠杆菌传感实验

使用涂布分离法将大肠杆菌分别配置成浓度为50，100，200，300，400，500，600 cfu/mL 7种菌液，分别置于离心管中，以备测试，每个浓度测试5组数据，并对所得数据用Origin软件进行平均筛选处理，即得如图5所示的光谱图。从图中可看出随着浓度的增加，传感器的干涉波谷呈现蓝移。其原因是：改性石墨烯复合敏感膜中的Con A可与溶液中的大肠杆菌特异性结合，薄膜折射率将随之改变，进而改变光子晶体光纤包层的有效折射率，导致光子晶体光纤中纤芯与包层存在的光程差发生改变，监测的干涉波谷将随之发生规律性移动。实验结果表明：该传感器在大肠杆菌浓度为50～600 cfu/mL内呈现出良好的线性关系，离散点是实际测量点，直线是线性拟合曲线，线性度较高(R2=0.956 49)。进一步分析表明，该传感器对大肠杆菌的灵敏度为3.43 pm/(cfu·mL-1)。

图5 不同浓度大肠杆菌的光谱响应Fig.5 Spectral response of E. coli with different concentrations

图6 大肠杆菌传感器的响应时间Fig.6 Response time of E. coli sensor

选用浓度为400 cfu/mL的大肠杆菌菌液加入水槽中来测试传感器的响应时间。实验中以3 s为取样间隔保存光谱数据，实验过程在室温下进行，测试结果如图6所示。该传感器从开始到响应完成所需时间仅15 s，说明该生物传感器能实现快速响应。

4.3 传感器检测限

依据国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)给出的检测限(Limit Of Detection，LOD)定义方程，即采用三倍的标准偏差除以拟合曲线斜率，由此检测限为[24-26]：

LOD=3σ/K，

(4)

其中：σ≈76.81 pm，表示空白组的标准偏差；K≈3.43 pm/(cfu·mL-1)，表示实验组的拟合曲线斜率。通过计算可知，该传感器的检测限为67.18 cfu/mL。

需要特别指出的是，实验中也选取了金黄色葡萄球菌和乳酸乳球菌等细菌进行了对比测试，由于这些菌的细胞膜中没有糖类物质，与Con A之间没有特异性的结合，虽然菌液浓度的变化会引起折射率的微弱变化，进而引起干涉谱图的移动，但这种移动非常微弱，可忽略不计。另外，因Con A是一种高分子蛋白，过高的温度(≥50 ℃)容易使它发生不可逆的变性，且大肠杆菌的最佳生存温度为37 ℃，在70 ℃下一分钟即可灭活，该传感器一般适合常温使用，因此本研究未对温度进行研究。同时，该传感器的敏感材料与大肠杆菌是特异敏感结合，若要恢复传感器的传感活性，需要在PBS缓冲液中低温充分浸泡或冲洗，因此，具体恢复时间还有待进一步的研究。

5 结 论

本文提出了一种基于改性石墨烯敏感膜涂覆马赫-曾德尔干涉结构的光纤大肠杆菌传感器，探究了它对大肠杆菌溶液的低浓度探测。结果表明：随着大肠杆菌溶液浓度的增大，干涉光谱发生了明显的蓝移，在50～600 cfu/mL内，传感器的灵敏度为3.43 pm/(cfu·mL-1)，线性拟合度良好，线性拟合系数为0.956 49，检测限为67.18 cfu/mL，响应时间为15 s。该传感器具有体积小、制作简单成本低、响应快等优点，在低浓度大肠杆菌液检测中具有潜在的应用价值。