饲料中添加厨余发酵产物对“中科3号”异育银鲫肝脏、肠道及肾脏显微结构的影响

■刘 洋 敖慧玲 蒋家鹏 刘立鹤* 刘 军

（1.武汉轻工大学动物科学与营养工程学院，湖北武汉430023；2.动物营养与饲料科学湖北省重点实验室，湖北武汉430023）

厨余垃圾也称餐厨垃圾，主要由米和面粉类食物残余、蔬菜及其他有机生活垃圾等组成，富含淀粉、蛋白质、脂类、纤维素、维生素和无机盐等多种营养物质[1]。厨余垃圾除了具有高水分、高油脂和高盐分等特点，还具有明显的空间地域特征。长期以来，填埋、焚烧是厨余垃圾最主要的处理方式，其次相当比例的厨余垃圾用于喂潲水畜禽，此外，堆肥和厌氧发酵也是常见的处理方式。随着我国社会经济、城市化和人民生活水平的提高，厨余垃圾产量日益增长，2017 年更是达到了惊人的2.15 亿吨[2]，随着城市周边土地资源的日益匮乏和环境污染加剧，尤其受到近期非洲猪瘟肆虐的影响，使得餐厨垃圾利用微生物快速处理，变废为宝，实现资源化利用变得越来越紧迫。

近年来水产养殖蓬勃发展，水产配合饲料需求强大，导致水产饲料原料缺口巨大，每年国内年需求量达8 000万吨，而缺口达4 000万吨以上，且蛋白饲料原料价格连年上涨已严重影响了我国饲料业和养殖业的发展[3]。而厨余垃圾经快速发酵后，具有营养丰富、安全的特征，在水产饲料上应用经济价值巨大。鲫鱼是我国传统的广温性杂食性鱼类，具有生长快、食性广、抗病力佳、适应性强的特征，便于养殖[4]。2017 年鲫鱼淡水养殖产量已达281.8 万吨[5]，“中科3号”异育银鲫是由中国科学院水生生物研究所研究团队历时10 余年培育出的新品种，适宜各种水体养殖具有生长快，抗病力强的特点。目前，已在江苏、湖北、广东和广西等多个省建立了良种扩繁和苗种生产基地[6]，发展态势迅猛。

不同饲料原料对动物及鱼类内脏组织形态及显微结构的变化极其显著[7-8]，因此，本试验添加不同比例厨余发酵产物（FPKW）的饲料饲喂“中科3号”异育银鲫60 d，添加不同比例FPKW对鲫鱼不同组织显微结构和形态的影响，初步确定FPKW在鲫鱼饲料中的适宜添加量，进而可为解决厨余垃圾处理和饲料原料短缺两者应用提供理论依据和数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验鱼种

试验用“中科3 号”异育鲫鱼鱼种购于湖北省名特优鱼类良种场孝感三汊基地，运至武汉轻工大学水产养殖基地，在2个2 m×2 m×2 m暂养池中驯养2周，期间投喂基础饲料。试验开始时前停食1 d，挑选体表无损伤，大小一致的鱼苗作为试验鱼。

1.2 厨余发酵产物

FPKW 由标优美生态工程股份有限公司友情提供，在Biom 生物环保厨余机BYM-F1-10加入厨余生物消化剂活化后，于每日12：00称重并加入南京建邺区新城科技园员工食堂的滤干厨余垃圾10 kg，持续投料30 d，第35 d 停机取出所得产物，经烘干、粉碎、过筛后即为FPKW，将样品置于-20 ℃冰箱备用。FPKW水分采用105 ℃常压干燥法测定；粗蛋白质含量采用凯氏定氮法测定；粗脂肪含量采用索氏抽提法测定，有机提取溶剂为乙醚；粗灰分含量采用马弗炉550 ℃灼烧法测定[9]。经分析其营养成分水：分含量为7.6%、粗灰分含量为5.7%、粗蛋白含量为18.7%、粗脂肪含量为20.4%、粗纤维含量为8.9 %，并且发酵产物中未检测出黄曲霉毒素和沙门氏菌等有害物质。

1.3 试验饲料

将FPKW按0%、3%、6%、9%、12%、15%的比例配置成6种等氮日粮，分别记为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组，添加30%组作为极高添加量组，配成等氮日粮记为Ⅶ组，其中1组为对照组，饲料配方及营养水平见表1。配置饲料时，各种原料均粉碎过60目筛，微量添加原料采用逐级扩大法进行充分混合，待所有组分混匀后，用常州市海江药化机械厂生产的XZL-250旋转式制粒机制作颗粒饲料，阴干后，置于-20 ℃下冰箱中储存备用。

表1 饲料配方及营养水平（干重基准）

1.4 养殖试验管理

养殖试验在武汉轻工大学循环水养殖系统中进行，试验缸直径80 cm，高80 cm，盛水300 L的蓝色圆形玻璃缸，每个处理组设3 个重复，每个重复放置(7.4±0.21) g 25尾鱼，试验期为60 d，日投饵3次，使其自由采食，投饵量为鱼总体重的2%～3%，每次投饵前关闭循环水，投饵结束待收集粪便后打开循环水，每周根据鱼体摄食和增重适当调整投饲量。试验用水为循环水，水温维持(20±1) ℃，24 h充气增氧，D.O＞5 mg/l，NH3-N＜0.1 mg/l，pH值为7.0～7.5。

1.5 鲫鱼组织切片制作与观察

试验结束停饲1 d，鱼体解剖和样品采集按照李承林主编的鱼类学教程中消化器官解剖及泌尿器官与生殖器官解剖方法进行[10]，将鱼体左侧向上，置于解剖盘中，左手握鱼，右手握剪，先在肛门前方剪一小的横切口，然后将一剪尖插入此切口，沿腹中线向前剪开至鳃盖下方，进入体内的剪尖稍向上挑，贴内壁剪。然后自臀鳍前缘向左侧背方体壁剪上去，沿脊柱下方向前至鳃盖后缘，将左侧体壁全部剪去，显示出内脏，用眼科剪和眼科镊从胃后部剪下，分离出肠道、肝脏，再用剪刀将围心腹腔隔膜的背缘除去，露出头肾，分离出肾脏。用吸头吸取无菌PBS冲洗消化道外壁，轻柔挤出肠道内容物，用无菌剪刀剪开肠道，用吸头吸取无菌PBS 冲洗数次，洗干净内容物，放到干净培养皿上，切取中肠、肝脏及肾脏组织块装入对应无菌离心管中，放入冰盒中。

解剖试验共七组，每组三个重复，每个重复2 条鱼，共42 条鱼。解剖试验完成后剩余鱼体单独放入自封袋，标记，在-80 ℃保存待测。

将取样完成的鲫鱼肝脏、肠道及肾脏组织样品用Davidson's 固定液固定5 h，随后在室温下以50%，70%、95%、100%浓度乙醇按梯度脱水各60 min，脱水后的样品移入水杨酸甲酯试剂中透明30 min，透明后的样品放入装有融化的石蜡蜡杯中浸蜡2 h，随后将样品包埋于石蜡中使样品凝固成块，横纵方向连续切制5 μm 厚的薄片，将切好的蜡片放在载玻片上置于45 ℃的展片台上烤干，H.E染色用曲长庆等[11]制作高质量动物组织切片的方法进行染色，中性树脂封片用于切片观察。肠道及肝脏样品于-80 ℃冰箱中保存备用，将肠道和肝脏解冻之后，分别称取1 g 组织，剪碎后，按W∶V=1∶10加入4 ℃、0.9%的生理盐水，在冰浴下用电动匀浆器匀浆。

采用倒置显微镜(XSP-16A)观察肝脏、肠道和肾脏组织的形态并拍照，每个切片随机选取6个视野进行拍照，以明美显微数码测量分析系统（Mshot Image Analysis System）采集图像并测量肠绒毛高度（绒毛顶端至绒毛基部）、肌肉层厚度及肠绒毛数量（每张图片随机取10个点测定后取平均值）。

1.6 数据处理与分析

数据使用“平均值±标准差”表示，数据用SPSS 18.0 统计软件进行单因素方差分析，若差异显著，则进一步采用Duncans'法进行多重比较分析组间差异性，P＜0.05表示具有显著差异。

2 结果

2.1 FPKW 添加比例对“中科3 号”异育银鲫肝脏显微结构的影响(见图1)

由图1 可知，0%、3%～12% FPKW 组鲫鱼肝细胞排列整齐，界限清晰，肝细胞索明显，肝血窦，少量细胞具有脂肪粒。15% FPKW组肝细胞核偏移，肝细胞被脂肪粒填充，细胞肿大。30% FPKW组肝脏细胞脂肪变性，肝细胞核溶解或变形。

2.2 FPKW 添加比例对“中科3 号”异育银鲫肠道显微结构的影响（见图2、表2）

由图2 可知，对照组肠绒毛细胞结构完整，细长且呈指状，形态较好，可见少量杯状细胞，上皮细胞核整齐有序排列在细胞基部，纹状缘完整，杯状细胞稀疏分布，3%～12% FPKW 组肠绒毛形态细长，上皮细胞核排列混乱，纹状缘完整，由表2 可以看出，3%～12% FPKW组肠绒毛高度及数量均高于对照组，肌层厚度则低于对照组。15%和30% FPKW 组肠绒毛宽厚且短，固有层变宽，上皮细胞核排列混乱，杯状体显著增多，肠绒毛高度均高于对照组但低于12% FPKW组，肠绒毛数量均低于其他组别，30% FPKW 组肌层厚度显著高于其他组(P＜0.05)。

图1 饲料中添加不同比例厨余发酵产物对异育银鲫肝脏组织的影响(×400)

图2 饲料中添加不同比例厨余发酵产物对异育银鲫肠道组织的影响(×400)

表2 不同比例厨余发酵产物对异育银鲫肠道结构的影响

2.3 FPKW 添加比例对“中科3 号”异育银鲫肾脏显微结构的影响(见图3)

对照组肾脏结构正常，肾小球、近端小管、远端小管结构完整清晰，可见致密斑；3%～12% FPKW 组肾脏结构清晰完整，肾皮质结构完整，其中9% FPKW组可见部分细胞毛细血管扩张或出血，12% FPKW组可见细胞纤维化，肾小管肿大；15% FPKW 组肾组织淤血坏死，炎性细胞浸润，近端小管、远端小管肿大或坏死；30% FPKW组肾组织淤血或坏死，组织纤维钙化，炎性细胞大量滋生，肾小体、肾小管细胞肿大或坏死。

图3 饲料中添加不同比例厨余发酵产物对异育银鲫肾脏组织的影响(×400)

3 讨论

随着FPKW 添加量从0%增加至12%时，“中科3号”异育银鲫的肝脏、肠、肾脏细胞显微结构完整，细胞形态较好，均无损伤，这暗示FPKW 作为一种鲫鱼的饲料原料是可行的，试验证实鲫鱼饲料中适量添加FPKW对鲫鱼的生理代谢、消化性能并无任何不良影响，这与本研究中鲫鱼的生长性能指标和酶活测定数据相一致。徐健[12]的研究，用发酵餐厨垃圾喂养黑水虻幼虫，获得了显著的增重效果，且对黑水虻幼虫成活率无不良影响，这也证实发酵后餐厨产物作为饲料或饲料原料的营养价值。鲁琳等[13]将厨余垃圾经微生物发酵后用于虹鳟鱼饲料，研究也证实适量的厨余发酵产物对虹鳟生长性能有一定促进作用，鉴于冷水鱼类对饲料原料的使用更加严苛，这也充分说明了FPKW 可以作为水产动物，尤其是鱼类的饲料来源。尽管鲁琳等[13]对虹鳟的研究中，厨余垃圾最适添加量仅为2.5%，与本研究在鲫鱼中的应用研究有较大差异，造成这种差异最大的可能是虹鳟和鲫鱼对天然饵料的选择性和适应性存在较大差异，在长期的进化中，鱼类通常具有通过调整消化酶活性和消化道，尤其是肝肠组织结构以适应饵料（或饲料）变化的能力[14-15]。有研究证实，草食性鱼类和杂食性鱼类对碳水化合物和纤维素的适应性和耐受性较强[16-18]，鲫鱼是一种广谱杂食性鱼类，对饵料的来源和种类具有更强的耐受能力，尤其对碳水化合物和纤维素的适应性较强。曾训江等[19]研究指出，湘云鲫鱼幼鱼对粗蛋白含量为27%的饲料中可消化碳水化合物的需要范围为28.67%～34.74%，纤维素的适应范围为13.25%～18.91%。本试验鲫鱼饲料中厨余发酵产物添加量高达12%，均未对鲫鱼的生长和脏器细胞形态造成不良影响，也从一个侧面佐证了FPKW的营养成分和毒素分析。相比而言，虹鳟属于冷水性偏肉食性鱼类，对饲料更为挑剔，对饲料中纤维素、淀粉含量以及蛋白质、脂肪的品质都较为敏感，尤其是一些毒素都更加敏感，这或许是造成添加量差异的重要原因。此外，本研究好氧发酵工艺是在相对封闭的箱体中，菌种发酵条件稳定，受到环境有害微生物的污染大大减少，从而有效避免了厨余垃圾发酵过程中因污染而导致有害有毒物质的滋生，也是导致添加量显著增加的一个原因。本试验中3%～12%FPKW 组鲫鱼肝脏、肠道及肾脏显微结构形态无损伤也可能与FPKW 的处理方法有关。有研究表明，发酵饲料不仅可以提高鲤鱼饵料利用率还可以提高其消化功能和非特异性免疫机能[20]。冯建等[9]用发酵豆粕替代鱼粉的实验中，发酵豆粕超过30%时会对大黄鱼幼鱼肝脏造成损伤，这与鲫鱼显微组织切片观察的结果一致。

肠绒毛数量以及肠肌层厚度直接影响着机体消化吸收营养物质的能力[21]，有大量研究表明，部分甘油酯及不饱和脂肪酸能促进肠道结构发育，提高肠道抗氧化及免疫功能，对保护鱼类肠道健康有显著作用[22-23]。有研究证实大豆黄酮可促进大菱鲆（Scophthalmus maximus）肠道组织结构的发育成熟，肠绒毛长度的增加[24]；胆汁酸可促进齐口裂腹鱼（Schizothorax prenanti）肠绒毛数量的增加[25]等。本试验中随着FPKW 添加比例达到9%时，异育银鲫肠组织切片中呈现出肠绒毛高度增加，肌层厚度降低，绒毛数量增多等特征，这说明适当的FPKW对异育银鲫的肠道生长发育与吸收能力有一定促进作用，而厨余中食物来源较复杂，通常都存在一定量的豆制品，是否与某些特殊的物质有关，还有待进一步研究证实。

本试验中厨余物的主要来源为餐厨垃圾，其中含有大量油脂和脂肪酸，同时也含有大量盐分。15%和30% FPKW组肠道组织杯状细胞显著增多，上皮细胞核增加，这可能与FPKW 中的高油脂、脂肪酸败有一定关系。肠上皮细胞不仅能起到消化作用还具有免疫作用，当肠上皮细胞受损或受到炎性细胞侵扰时，它将通过来源于隐窝的干细胞增殖、分化、迁移来补充维持组织更新[26]，在肠道黏膜受损时，杯状细胞分泌的三叶状蛋白可与细胞因子和生长因子发生协同作用，加快上皮细胞的愈合[27]。丙二醛是脂质氧化的终产物，有研究证实丙二醛（MAD）可以对草鱼肠道黏膜屏障造成损伤[28]，这可能引发了肠上皮细胞免疫机制使得上皮细胞核及杯状细胞显著增多，从肠道切片可知FPKW 不超过12%时未引起异育银鲫肠道结构的明显变化，这可能是鱼类肠道微生物数量庞大且复杂，其组成变化与环境因子及宿主个体密切相关，在维持肠道健康，促进肠道发育，抵抗病原入侵，调节机体能量吸收和脂质代谢过程中发挥着重要作用，对某些不利因子具有一定耐受限度[29-30]。另外FPKW中的高油脂可能也是引起鲫鱼肝细胞脂肪性变性，肝细胞被脂肪滴填充肿大或坏死特征的主要因素，有研究表明，饲料中脂肪含量过高会造成饲料效率及蛋白质效率降低并使腹腔体脂过度沉积[31]，对鲫鱼的肝脏造成损害。厨余物添加饲料中的高油脂可能部分被氧化，过多的氧化油脂若不能被肝脏中抗氧化酶及时有效分解，将会引起鲫鱼氧化应激反应而使肝脏受到损伤。如任泽林等[32]用氧化鱼油饲喂鲤后发现鲤肝胰脏细胞受损。

在本研究中，15%、30%FPKW 组肾小体、肾小管细胞肿大，炎性细胞大量滋生，组织纤维钙化、淤血或坏死，这可能与FPKW 中的高盐分性质有关，大量的流行病学调查及实验研究表明盐作为重要的环境因素，在高血压的发生发展中起着重要的作用[33-34]。这不仅影响了血压调节，而且还可能独立于血压对心、脑、肾等器官的损害产生作用。国内外文献报道，高盐可诱导高血压大鼠肾脏纤维化[35-37]。鲫鱼可能因长期食入高盐饲料，引起肾组织负担加重，肾脏受损。Galat 等[38]和林华英等[39]分别在研究盐度对褐色鲑(Salmo clarki lewisi)和鲈（Micropterus salmonides）肾组织结构影响时也发现其在高盐条件下，鱼的肾组织退化，肾小球缩小甚至消失，肾小管缩短等病理现象。

4 结论

综上所述，厨余发酵产物在饲料中的添加比例不超过12%是可行的。