许昌烟草根腐病的分子鉴定及致病性分析

姚 健，刘玉珍，李建华，王 京，孙晓伟，李肖宇，法鹏飞，危月辉*

(1.河南省烟草公司 许昌市公司，河南 许昌 461000； 2.福建三炬生物科技股份有限公司，福建 厦门 361001； 3.福建省生物肥料企业 工程技术研究中心，福建 厦门 361001)

烟草属茄科(Solanaceae)烟草属(Nicotianna)红花烟草种(N.tabacum)，是一年或多年生草本植物，是我国一类重要的经济作物。作为卷烟的主要原料，其品质与产量却常年遭受病虫害这一因子的制约[1]。根据现有研究表明，烟草病虫害的发生与传播，将直接导致其产量损失达到10%～15%。根据调查研究结果表明，烟草病害种类非常多，全世界范围内至少可以达到100多种，在我国目前已经发现的具有侵染性的病害就已经达到了60多种，其中引起根茎类病害的主要有烟草疫霉黑胫病、根串珠霉根黑腐病、镰刀菌根腐病、青枯病以及猝倒病等[2-3]。

由镰刀菌病原菌侵染烟草根部引起的根腐病是世界性的土传性真菌病害，普遍存在于我国云南、河南、福建、贵州、四川等烟草主要产地，这不仅制约了我国烟草产业的快速发展，同时也造成了巨大的经济损失。由于烟草根腐病常常会与烟草黑胫病、青枯病或其他根茎部的病害一起发生，造成生产上准确诊断该病害存在困难，因此，确定当地引起发病的病原菌种类及其致病力的强弱是指导烟草根腐病防治的基础[4]。以往单纯依靠形态特征不能解决许多植物病原菌种类分类地位的问题，近年来，依据形态学特征结合分子生物学分析，解决了包括烟草等很多此类问题[5]。目前主要使用化学药剂来防治烟草根部类病害，但在生产实践中发现，只采用一种方法是很难达到防治该病害的效果，需要采用多种手段一起进行防治，科学协调农业防治、化学防治和生物防治有效措施，这样才能经济、有效地进行烟草根茎病害的防治[6]。

河南省许昌烟区属于传统烟区，常年的烟草种植，使烟区很多地方根部类病害不断扩散，严重影响了烟草产量和质量，因此我们应该十分重视该类病害，并采取相应的有效防治措施来避免或者减少该类病害的暴发[7]。目前，已有研究报道河南省的烟草根腐病现状，但关于引起该类病害的病原菌种类，以及不同烟草种植区域病原菌致病力的差异和该病原菌侵染烟草根部引起的病害等都缺乏系统性的研究。因此，本研究以许昌烟区发病的烟株以及根际土壤为研究材料，从中分离纯化出疑似烟草镰刀菌病原菌，并对其进行形态学鉴定、rDNA-ITS序列测定及分析、致病性强弱测定，初步确定引起许昌烟草根腐病的镰刀菌种类，以期为许昌烟草根腐病的判断与有效防治提供一定的指导。

1 材料与方法

1.1 样品采集

于2018年烟草主要病害发生季节，从许昌市各烟区(禹州范坡、许昌县、襄县王洛等)，采集具有典型根腐病症状的根部以及土壤，用无菌塑料袋将其分装带回实验室，放入4 ℃冰箱中保存备用。

1.2 分离培养基

PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、氯霉素0.1 g、琼脂15～20 g、蒸馏水1000 mL，自然pH值。

1.3 试验方法

1.3.1 病原菌分离 在烟草发病田采集烟草病株，并对其进行分类。对于具有明显病症的根和茎，可直接挑取其菌丝体、子实体、霉状物或菌核等，在无菌环境下接种至提前配置好的PDA培养基上，重复做2～3个平板，28 ℃恒温培养箱中培养3～5 d；对于没有明显病症的根和茎，采用组织分离法对病原菌进行分离，在简易条件下营造洁净的工作环境，利用酒精灯火焰灭菌然后形成一个无菌的小环境，剖开烟草新鲜发病的茎秆，用镊子取病茎内碟片状的病髓片，置于预先制备好的固体培养基上，每个平板接2～4个病髓片，做2～3个平行，28 ℃恒温培养3～5 d。定期观察平板上的菌落生长状态，从中挑取单一的菌落进行分离纯化培养，观察和记录菌落特征，并挑取菌丝体，制作成切片，进行镜检并拍照，最后将分离纯化后的单一菌株转接到提前配置好的PDA试管斜面培养基上，置于4 ℃冰箱中保存[8-9]。

1.3.2 烟草根际土壤病原菌的分离 称取烟草病株根际土样10 g，装进加有100 mL无菌水的250 mL锥形瓶中，将锥形瓶置于220 r/min的振荡器上振荡5 min；配置成稀释度为10-1～10-6的根际土壤悬液，分别吸取10-4～10-6不同稀释度的土壤悬液100 μL，用涂布棒均匀涂布到PDA培养基固体平板上，每个稀释度涂布2～3个平板，置于28 ℃恒温培养箱中培养3～5 d，观察菌落生长情况，挑出其中的单菌落继续进行纯化培养，观察和记录菌落特征，然后挑取菌丝体、子实体等，制作成切片，进行镜检并拍照记录，最后将分离纯化后的单一菌株转接到提前配置好的PDA试管斜面培养基上，待菌丝体长满斜面后置于4 ℃冰箱中保存[10]。

1.3.3 病原菌的分子鉴定 在形态学特征和生理生化鉴定的基础上，利用rDNA-ITS分子生物学技术进一步鉴定该病原菌。挑取分离纯化得到的可能为根腐病病原菌的菌株，采用CTAB法提取病原菌的基因组DNA，并用PCR特异性引物进行扩增，PCR扩增引物、反应体系及扩增程序参见文献[11]。将具有特异性条带的扩增产物送至广州睿博兴科进行rDNA-ITS测序，测得的序列与GenBank中的相关数据进行Blast相似性分析[12]。

1.3.4 病原菌致病性的测定 烟苗在福建三炬生物科技股份有限公司研究院实验室培育至4叶期。将分离获得的纯培养菌株接种到马铃薯葡萄糖液体培养基中，置于28 ℃、200 r/min恒温振荡器上振荡培养5～7 d，用无菌水将病原菌培养液制备成浓度为106～107个/mL的孢子悬液，备用。挑取肉眼看起来健康并长势大概一致的烟苗进行灌根接种，每株烟苗灌10 mL孢子悬液，每个处理5株烟苗，每个处理重复3次，将灌10 mL清水的烟苗作为对照，置于25～28 ℃温室中培养，接种2周后开始定期观察并记录烟苗的发病情况。采用组织块分离法、划线分离法对发病烟苗重新进行分离，并镜检观察分离物与接种物是否一致[13-14]。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离结果

采用培养真菌用的PDA培养基对烟草病原菌进行分离，挑取单菌落进行平板划线进行多次分离纯化，记录单菌落的形态特征，并对其进行编号，转接至斜面培养基上保存(表1)。从4个地区采集的样品中共分离得到38株菌株，经过形态观察和镜检，其中10株菌株可能为根腐病病原菌，分别为W1J-2、W1T-3、W2G-2、XG-1、W2T-3、XJ-2、YJ-6、XG-2、XJ-1、W1G-2(图1)。

表1 部分菌株的形态特征

图1 菌株YJ-6和XG-1的菌落形态和镜检结果

2.2 病原菌的鉴定结果

通过对菌株进行分子生物学鉴定，对测序获得的rDNA-ITS基因序列进行BLAST分析，各病原菌与系统发育关系最近种属的菌株rDNA-ITS基因相似性如表2所示。从表2可知，烟草病原菌rDNA-ITS基因序列与GenBank数据库中已报道的相关菌株rDNA-ITS基因序列的相似性均达到99.21%以上，菌株YG-1、W2G-2、XG-1、YJ-6、XJ-2、W1J-22与尖孢镰刀菌的相似性达到99.52%以上，由此可初步说明烟草的优势病原菌归属于镰刀菌属。由于分子鉴定的结果与形态学鉴定的结果一致，从而可以初步判定引起许昌烟草根腐病的病原菌为尖孢镰刀菌。

2.3 病原菌致病性分析

分离、纯化得到的病原菌主要是腐皮镰刀菌和尖孢镰刀菌2种，为进一步确定其致病性强弱，采用伤根接种法进行病原菌的致病性测定。试验结果显示，在健康而且长势一致的烟草幼苗上分别接种腐皮镰刀菌、尖孢镰刀菌和无菌水(对照)，14 d后，接种尖孢镰刀菌的烟草幼苗呈现萎蔫症状，拔出烟草幼苗，其近地面的茎部已变为黑褐色，用自来水将发病的烟苗冲洗干净后发现它的根部全部发病，主根根部出现黑褐色病斑，表现最为严重的植株，其主根腐烂引起植株枯死；接种腐皮镰刀菌的烟草幼苗，呈现轻度的萎蔫症状，在近地面的病健交界处会长出新根，以维持其自身生长；接种无菌水的烟草幼苗长势良好，植株未出现萎蔫症状，根系生长旺盛，根部没有出现腐烂症状。采用组织块分离法、划线分离法对病株上的病原物进行分离，发现分离纯化后得到的病原菌与接种的病原菌形态特征相同，由此证明，分离纯化出来的病原菌是引起烟草根腐病的病原菌。从致病性结果总结得出，可进一步确定烟草根腐病主要致病菌为尖孢镰刀菌。

表2 烟草病原菌与相关菌株的rDNA-ITS基因序列相似性

图2 接种无菌水和烟草病原菌的症状

3 结论与讨论

本研究通过对从发病烟草根部分离得到烟草根腐病病原菌菌株的形态学观察和分子生物学鉴定，并结合致病性测定的结果，造成根腐病的病原物主要是腐皮镰刀菌和尖孢镰刀菌属的真菌，尖孢镰刀菌为主要致病菌，这一试验结果与陈高航[9]研究认为的烟草根腐病的优势病原菌为尖孢镰刀菌的结论是一致，但与吴安忠等[15]研究认为的共享镰刀菌是烟草根腐病的优势病原菌结论不一致，这可能与不同地区、不同品种的烟草有关[16-17]。

镰刀菌属于真菌，其数量、种类非常庞大，而且随着环境的改变，变异的频率非常高，因此，只依靠传统的单一的形态学鉴定方法对镰刀菌进行分离、纯化、鉴定，很难准确地确定该病原菌的分类地位。随着分子生物学、高通量测序和基因工程等技术的快速发展，研究学者们已经研究发现真菌的rDNA-ITS区的基因序列比较稳定[18]，我们可以利用真菌的这个特点，从现代分子生物学的角度对镰刀菌进行属及种水平上的分类鉴定，这样的话可以在一定程度上减少形态学鉴定的主观性。