扩散加权成像和循环肿瘤细胞对食管鳞癌患者放化疗短期疗效的预测价值

贾争艳，吴小源，刘杨，路双，秦建军，曲金荣

食管癌是世界上第7种最常见的恶性肿瘤类型，包括每年57．2万新发病例，也是第6大癌症相关死亡原因，其死亡率占所有恶性肿瘤的5．3%［1］，食管癌包括鳞癌、腺癌等，食管鳞癌（esophageal squamous cell，ESCC）是我国食管癌最主要的病理类型。ESCC患者主要治疗方法是手术切除，然而对于不能切除或食管切除术禁忌的ESCC患者，放化疗是治疗的主要手段，已经有研究证明放化疗能改善预后［1］。然而，放化疗只对治疗有效的患者有利［4］，还可能引起骨髓抑制、食管瘘、大出血等副反应［5］，因此确定可靠的指标来预测放化疗治疗疗效是至关重要的，以确定哪些患者可从放化疗中获益最大，从而制定真正的个体化治疗方案。

磁共振扩散加 权成像（diffusion weighted imaging，DWI）是磁共振的功能序列，其根据兴趣区（region of interest，ROI）组织中水分扩散特征计算得到的生理参数称为表观扩散系数（apparent diffusion coefficient，ADC）值，是DWI成像的量化指标［6］。DWI是一种无创、可重复的工具，可以作为有用的影像学标志物在评估肿瘤的侵袭性以及患者对放化疗的治疗反应能力方面，并且已在预测食管癌、直肠癌、肺癌放化疗短期疗效中得到充分证明［6－8］。循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）是指实体肿瘤原发灶或转移灶中释放到血液循环的肿瘤细胞，然后在血液中可以扩散到其他器官。CTCs作为一种预测ESCC患者预后的生物学标志物［9］，其监测对于指导ESCC的治疗有重要意义［10］，然而目前尚少有文献报道CTCs与放化疗短期疗效的关系，没有文献报道CTCs联合ADC值能否提高预测放化疗疗效的能力。本研究旨在探讨CTCs、ADC值及二者联合预测ESCC患者放化疗短期疗效的能力。

材料与方法

1．一般资料

回顾性搜集河南省肿瘤医院2016年11月－2018年4月收治的经病理组织活检确诊的69例ESCC患者。入组标准：①化疗前7天内有MRI和CTCs检测；②入组前未行放化疗、手术等抗肿瘤治疗；③无其他肿瘤病史；④有正常的骨髓功能和肝肾功能，没有严重的合并症；⑤放化疗治疗前及治疗结束1个月后有胸部增强CT、上消化道造影等检查资料。排除标准：①不能耐受放化疗，治疗过程中反复出现骨髓抑制及严重感染等；②放疗过程中出现食管纵隔瘘；③患者医从性差，未完成放化疗；④图像质量差，影响图像分析。最终共有51例ESCC患者入组，排除18例，排除原因如下：8例医从性差，退出实验，2例出现食管纵隔瘘，3例骨髓抑制，肺部感染，反复发热未能完成放化疗，5例图像质量差。最终对51例患者的临床及影像学资料进行分析。51例患者中，男29例，女22例，年龄42～77岁，中位年龄为64岁。肿瘤部位：胸上段9例，胸中段34例，胸下段8例。T分期：T1期2例，T2期9例，T3期26例，T4期14例。临床分期：Ⅰ期1例，Ⅱ期14例，Ⅲ期9例，Ⅳ期27例。本研究由本院医学伦理委员会批准（编号2015ct068）。根据国际抗癌联盟（UICC）和美国癌症联合委员会（AJCC）（UICC／AJCC）第八版食管癌分期［11］进行TNM分期。

2．放化疗方案

化疗方案为静脉注射紫杉醇70mg／m2（第1天、8天），静脉注射达奈铂剂量为30mg／m2（第1～3天），两个周期间隔21天，共2个周期化疗，化疗2个周期后休息2周，待骨髓功能恢复后对病灶进行放疗，放射治疗采用同期加量调强放疗，并用CT机定位，制定放疗计划，处方剂量是1．8～2．0Gy／次，每周5次，1次／天，总剂量58～65Gy。放疗28次剂量达50Gy时复查上胸部增强CT及上消化道造影，以进行初步疗效评价并重新用CT机定位，制定新的放疗计划。

3．CTCs检测方法

采用广州益善生物技术股份有限公司CanPatrolTMCTC二代富集技术检测平台及RNA多重原位杂交分析（RNA in situ hybridisation，RNA－ISH）系统。采用美国BD公司纳米膜，采用美国Invitrogen公司CK8探针、CKl8探针、Twist探针、Vimentin探针等。

在化疗前7天内使用8号采血针和EDTA抗凝采血管采集ESCC患者5mL外周血。CTCs细胞分离采用CanPatrolTMCTC－二代富集技术，具体细节技术如CanPatrolTM文献报道［12］，操作严格按照产品说明书，通过直径8μm纳米膜分离和富集CTCs，然后用RNA－ISH技术对所得CTCs细胞进行标记鉴定。RNA－ISH大致流程为：①用透化剂及消化酶对分离样本进行预处理，随后加入特异性的RNA探针进行在40℃恒温箱中孵育3h，不同表型CTCs的特异性探针RNA包括上皮型探针（EpCAM，CK8／18／19）、间质型探针（Vimentin，Twist）与CD45（各探针序列详见文献［12］）；②扩增探针杂交，加入在40℃恒温箱中孵育3h的预扩增工作液和扩增探针工作液，在40℃恒温箱中，孵育3h；③使用标记有荧光基团的探针与扩增探针进行杂交，产生荧光信号，加入显色信号探针工作液，置于40℃恒温箱中，孵育30min；④10UL复染液加入样本上中，室温静置15min后利用自动识别系统，自动判读结果。

CTCs分型：上皮型CTCs（Epithelial CTCs）仅上皮型探针阳性，检测为红色荧光信号点（图1a）；间质型CTCs（Mesenchymal CTCs）仅间质型探针阳性，检测为绿色荧光信号点（图1b）；混合型CTCs（Hybrid CTCs）为上皮型探针和间质型探针阳性，同时检测为红色荧光和绿色荧光信号点（图1c）。

4．MRI检查方法

采用Siemens Skyra 3．0TMR扫描仪和体部18单元相控阵腹部线圈进行扫描。检查前6h禁饮食，15～20min肌内注射盐酸消旋山莨菪碱注射液10mg（杭州民生药业）。扫描前对患者进行呼吸训练，患者头先进，仰卧位。进行常规的MRI平扫及DWI扫描。扫描序列参数：横轴面自由呼吸压脂T2WI：层数40，层厚5mm，TR 6787．00ms，TE 96．00ms，矩阵226×384，视野273mm×380mm；横轴面屏气DWI：层厚5mm，TR 2600．00ms，TE 51．00ms，矩阵92×128，视野288mm×400mm，b值分别为50、700s／mm2。

5．图像分析

由两名具有5年以上从事胸部影像诊断经验的影像科医师，对MRI图像质量采用5分制进行评分，两名医师评价图像意见不一致，由第3名高年资医师参与讨论，最终达到一致意见。评价标准［13］：5分，非常好，无伪影，病变显示非常清晰；4分，好，无伪影，病变显示清晰；3分，尚可，有轻微伪影，不影响病变评价；2分，可以接受，有伪影，可能影响病变评价；1分，差，伪影明显，影响病变评价。

为了排除伪影对ADC值的影响，DWI图像评价≤2分者，认为扫描失败，排除入组，采用双盲法阅片，并对评价≥3分的图像进行定量分析。取两名医师的定量测量结果平均值作为最终结果。在PACS（Neusoft version 5．5）上进行ADC值测量，参照T2WI形态，取瘤体显示最清楚、最大层面为ROI，尽量避免肉眼可见肿瘤坏死区域，测量实质瘤体的ADC的值，ROI范围约为22．31～382．76mm2，平均值141．57 mm2。结合T2WI序列测量病变的厚度和长度。

6．短期疗效评价

图1 a）上皮型CTCs，红色荧光信号；b）间质型CTCs，绿色荧光信号；c）混合型CTCs，红色荧光信号及绿色荧光信号。

放疗结束后1月对短期疗效评价，参照实体瘤疗效 评 价 标 准（response evaluation criteria in solid tumors，RECIST 1．1）［14］标准评价治疗疗效。①完全缓解（complete remission，CR）：所有靶病灶消失；②部分缓解（partial remission，PR）：靶病灶最大径至少减少30%；③病变进展（progression disease，PD）：靶病灶最大径增加20%以上，或者出现一个或多个新病灶；④病变稳定（stable disease，SD）：介于部分缓解和疾病进展之间。将CR及PR分为缓解组（remission group），SD及PD为未缓解组（non－remission group）。

7．统计分析

所有数据均采用SPSS 24．0或Medcalc 18．11软件进行统计分析。采用Kolmogorov－Smirnov检验确定定量参数是否服从正态分布。正态分布的数据采用表示，非正态分布的数据以中位数和四分间距表示。正态分布数据采用独立样本t检验分析，非正态分布数据采用Mann－Whitney U或Kruskal－Wallis H检验用于分析。分类资料以频数表示，采用卡方检验进行比较。受试者操作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）分析治疗前ESCC的ADC值、CTCs及两者联合对放化疗疗效的预测价值。使用Z检验比较各参数ROC曲线下面积（area under curve，AUC）。Youden指数（敏感度＋特异度－1）最大对应的值作为临界点（cut off）。采用Kappa一致性检验，计算两名MRI医师对图像质量评分的一致性，采用Bland－Altman评价两名医师测量放化疗前ADC定量参数的一致性，计算内组相关系数（intraclass correlation coefficient，ICC）。采用Person等级相关来评价ADC值和CTCs的相关性。∣r∣＜0．3，相关性极差可视为不相关；0．3≤∣r∣＜0．5，低度相关；∣r∣≥0．8，高度相关，所有统计分析都是双侧的，以P＜0．05为差异具有统计学意义。

结 果

1．两名医师对图像质量及ADC值的一致性分析

两名医师对图像质量评分的一致性非常好，Kappa值为0．815（P＜0．001，表1），两名医师对ADC测量的一致性较好，ICC为0．912（P＜0．001）。

表1 2名医师对51例患者图像质量评分

2．CTCs与患者临床特征及ADC值的相关性

CTCs总数及各亚型在T分期、N分期、临床分期及肿瘤位置中的差异无统计学意义（P＞0．05，表2）。CTCs总数及各亚型CTCs与ADC值不相关（P＞0．05，图2）。

3．CTCs水平及ADC值对放化疗短期疗效的评估结果

放化疗结束1个月后进行疗效评价，51例患者中，14例CR，20例PR，14例SD，3例PD，缓解组（CR＋PR）共34例，未缓解组（SD＋PD）共17例。放化疗前，缓解组与未缓解组患者的性别、年龄、肿瘤部位、病变长度及病变厚度的差异均无统计学意义（P＞0．05，表3）。放化疗前，缓解组ADC值低于未缓解组，差异有统计学意义（Z＝－2．857，P＝0．004，表3）。放化疗前，缓解组间质型CTCs高于未缓解组，差异有统计学意义（Z＝－2．333，P＝0．020，表3）。放化疗前，缓解组与未缓解组中上皮型CTCs、混合型CTCs、总CTCs差异无统计学意义（P＞0．05，表3）。

表2 各表型CTCs检测与51例ESCC患者临床特征的关系

图2 CTCs和ADC值的相关性分析。 图3 ADC值、间质型CTCs及两者联合的诊断ROC曲线，其中ADC值联合间质型CTCs的AUC最大。

表3 缓解组与未缓解组临床特征及各参数假设检验

4．ROC曲线评价ADC值及CTCs各自及联合的诊断效能

选取Youden指数最大时对应值计算临界点，当ADC值临界点为0．983×10－3mm2／s，敏感度、特异度分别为76．5%、79．4%。当间质型CTCs临界点为0，敏感度、特异度分别为70．6%、61．8%。经ROC曲线分析，ADC值、间质型CTCs和两者联合的AUC分别为0．747、0．689和0．825（P＜0．05，表4，图3），两者联合AUC比单一参数AUC大，并且与间质型CTCs的AUC比较，差异有统计学意义（Z＝2．025，P＝0．004），但两者联合的AUC和与ADC值的AUC比较，差异无统计学意义（Z＝1．708，P＝0．088）。

讨 论

本研究结果显示，治疗前ADC值、间质型CTCs可以作为预测ESCC放化疗短期治疗疗效的方法；两者之间独立不相关，两者联合对预测放化疗疗效的诊断价值最高，具有中等诊断价值。然而，ADC值及间质型CTCs的界定域值还有赖于大样本及多中心临床研究。

表4 ROC检测ADC值和间质型CTCs的曲线下面积及其假设检验

CTCs已广泛应用于肿瘤治疗的各个方面，如监测肿瘤复发和治疗效果、确定药物选择策略、预测肿瘤患者的生存等，目前的临床研究显示CTCs与乳腺癌、肺癌、肝癌、结直肠癌的发生、转移和复发有着明确的相关［15－16］，在 食 管 癌 研 究 中Han等［17－18］发 现，CTCs阳性患者无进展生存期明显短于CTCs阴性患者，CTCs是预测肿瘤复发预后，独立并有力的指标，在食管癌放化疗疗效监测中，Matsushita等［18］发现治疗后CTCs由阳性转为阴性的患者或治疗前无CTCs的患者预后较好。但是目前在食管癌患者CTCs的研究中，大多数使用基于上皮标志物标记的CTCs，通常使用Cell－Search或流式细胞术［19］。上皮－间质转化（epithelial－mesenchymal transition，EMT）的过程在促进肿瘤细胞的迁移和侵袭中发挥重要作用，是一个涉及许多分子和细胞变化的多步骤过程，最终导致上皮标记物如上皮细胞粘附 分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）和细胞角蛋白表达下调，间质标记物如twist和vimentin表达上调，它可能导致基于EpCAM检测的假阴性结果［20－22］。本研究中，我们采用CanPatrolTMCTC－二代富集技术对ESCC患者外周血进行CTCs分离，并且采用RNA－ISH技术对分离到的CTCs分析，根据EMT相关标志物进行亚型分型鉴定并鉴定出上皮型、间质型、混合型等3种不同亚型的CTCs，弥补了CellSearch等基于EpCAM检测的不足。有研究表明确定CTCs亚型可能有助于识别最具侵袭性的CTCs亚型并确定合适的治疗方法［23－24］，因此，有必要根据EMT标志物的表达情况对CTCs进行分型鉴定。

本研究发现，ESCC患者的CTCs各表型在不同T分期、N分期及临床分期种差异均没有统计学意义，而陈威鹏等［25］研究间质型CTCs水平与临床分期和T分期等相关，间质型CTCs在晚期癌症中最为常见，本研究与其结果不一致，可能与样本量较小、大部分患者分期较晚有一定的关系。多项关于EMT的研究表明，在某些癌症类型中，间质型CTCs与肿瘤进展和治疗耐药有关，在多变量分析中，与没有CTCs或上皮型CTCs的患者相比，间质型CTCs与预后不良相关［25－27］，但尚未见报道间质型CTCs计数与放化疗反应的关系。在本研究中放化疗前间质型CTCs水平高低与治疗的疗效有明显的相关，间质型CTCs水平越高，放化疗治疗疗效越好，分析原因可能为肿瘤细胞的分化程度越低，恶性程度越大，细胞排列越扩散，聚集能力越弱，进入血液循环的几率越大，放化疗效果越好。

DWI表示水在组织中的扩散程度，可以提供肿瘤病变的病理、生理和分子运动信息，并且通过观察水分子在不同组织间自由扩散的变化，将细胞密度较高的肿瘤组织与正常组织区分开来，炎症、缺氧、细胞密度和细胞膜完整性等一些内在因素影响水在组织中的扩散［28］。DWI作为ESCC预后的独立预测因子，多项研究［29－31］都显示，ADC值较高预后较好，ADC值较低预示ESCC患者的生存率较低，但是对于预测ESCC患者放化疗短期的治疗疗效却不一致，Aoyagi等［31］认为放化疗前高ADC值组放化疗治疗疗效优于低ADC值组，Guo等［30］研究未证实ADC值与放化疗短期治疗疗效之间的相关性，陈伟等［28］和Ye等［29］研究认为放化疗前低ADC值组放化治疗疗效优于高ADC值组。这些研究中ADC值与治疗疗效相关性的变化可能是由于不同的仪器、不同的软件或使用的不同b值，以及不同病理类型造成的。本研究显示治疗前缓解组ADC值低于未缓解组，与陈伟等［28］和Ye等［29］研究表明放化疗前低ADC值组比高ADC值组有较好的治疗疗效相一致，其原因可能为ADC值与肿瘤细胞密度呈负相关，高ADC值组肿瘤组织内可能存在较多的坏死，而肿瘤坏死的存在使细胞密度减低，ADC值增加，导致对放化疗的敏感性降低［32］，并且有研究表明ESCC患者的ADC值和肿瘤的胶原蛋白和血管生呈负相关，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）能特异性作用于血管内皮，在肿瘤新生血管中起关键作用，并且有研究表明VEGF阳性患者对放疗的敏感性高于VEGF阴性的患者［6，33－34］，因此低ADC值组中可能有较多的血管生成，更有利于对药物的吸收，因此对放化疗更敏感。

本研究采用MRI定量参数联合血液循环中肿瘤生物学标志物，探讨预测放化疗疗效的最佳诊断效能模型，结果显示间质型CTCs参数诊断效能结果中Youden指数偏低（0．3235），预示诊断效能不高，可能由于本文搜集病例较少有关，但本研究中ADC值联合间质型CTCs可明显提高预测放化疗疗效的诊断效能。以往研究中Zhao等研究［35］中显示MRI定量参数联合免疫组织化学标志物，预测胆管癌早期复发有较高的诊断效能，林海明等研究［36］中MRI DWI联合血清CA125检测诊断卵巢肿瘤有较高的诊断效能及临床应用价值。他们研究与本文研究结果相似，MRI定量参数联合肿瘤生物学标志物可能为疾病的诊断与疗效预测提供新的方法，从而为患者提供真正的个体化治疗方案。

然而，本研究有几个局限性。首先，本研究中ESCC早期患者较少，可能导致CTCs与TNM分期不相关，因为分期较早患者一般进行手术治疗，放化疗患者一般为分期较晚患者，因此本研究入组的早期患者较少。其次，本研究没有动态观察放化疗后ADC值及CTCs值的动态变化及变化值，可能导致ADC及CTCs值与治疗疗效的相关性讨论不充分，今后需进一步补充收集这部分病例。最后本研究只观察了ESCC放化疗的短期疗效，ADC值与CTCs与患者长期疗效及预后暂未观察到，患者长期疗效目前还在随访中。

总之，ADC值及间质型CTCs可以作为预测ESCC患者放化疗短期疗效的方法，其中两者联合对预测放化疗疗效诊断价值最高，可以作为预测食管鳞癌放化疗短期疗效的新方法。