扩散加权成像联合外周循环肿瘤细胞对食管鳞癌病理分级的预测价值

路双，张宏凯，贾争艳，赵妍，秦建军，曲金荣

食管癌就诊时大多处于中晚期，预后不良，目前食管癌主要治疗方法为手术根治，但术后五年生存率仅为15%～25%［1］，主要为不明原因的转移。近年来发现食管癌生物学行为不同，相应的分化程度也不同，食管癌病理分级是影响肿瘤预后的独立因素［2－3］，术前对其准确的评估，对于食管癌个性化治疗方案有很重要的意义。扩散加权成像（diffusion weighted imaging，DWI）是在水分子的迁移状态基础上来确定水分子在组织中自由扩散的程度，可用表观扩散系数（apparent diffusion coefficient，ADC）值来量化。ADC主要受细胞大小、密度、包膜完整性的影响。正常细胞由于肿瘤细胞的侵袭，失去完整的包膜，因此ADC值升高。ADC值近年来已经成为肿瘤治疗反应的潜在标志物［4－6］。外周循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）为肿瘤细胞离开原发肿瘤进入血液循环系统［7］，CTCs与肿瘤的转移、复发、疗效评估、预后判断有关，已被认为是食管癌预后不良独立危险因素［8－10］。上皮间充质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是一个复杂的过程，为CTCs携带的上皮相关成分减少，而间质相关成分增多，从而实现细胞表型的转换，EMT与肿瘤的侵袭和播散关系密切［11－13］。以往的研究已经证明ADC值的大小以及CTCs值可以在一定程度上反应食管癌病理分级［14－15］，但是二者之间的关系尚未研究，本文旨在探讨二者对低分化食管鳞癌诊断效能以及两者联合与食管癌病理分级的关系。

材料与方法

1．临床资料

收集2016年11月－2018年5月河南省肿瘤医院符合以下条件的患者。纳入标准：①所有患者均经活检病理证实为食管癌患者；②检查前未接受抗肿瘤治疗；③所有患者最终均行食管癌根治术。排除标准：①活检病理证实为非鳞癌患者；②未行MRI检查；③MRI图像质量不能满足要求；④病变最大层面面积＜10mm2。

共收集81例患者，排除6例食管非鳞癌患者、5例图像质量不能满足诊断要求及2例病变最大层面较小难以勾画者，最终68例食管鳞癌患者纳入本研究，男50例，女18例，年龄42～74岁，平均（61±8）岁。42例患者直接行食管癌根治术，26例局部进展期食管癌患者（cT1－4aN＋M0或cT3－4aN0M0），先行两周期新辅助化疗，评估可手术后行食管癌根治术。

2．MRI检查方法

采用Siemens Skyra3．0TMRI和体部18单元相控阵线圈进行扫描。禁食6h，扫描前15～20min肌注盐酸消旋山莨菪碱注射液缓解食管蠕动。扫描前患者常规训练呼吸，取仰卧位，足先进。常规扫描屏气T2WI冠状面、矢状面及T2抑脂序列，T2抑脂序列层厚5mm，TR6097．44ms，TE96．00ms，矩阵226×384，视野273mm×380mm；屏气T1WI正反相位，层厚3mm，TR2．7ms，TE0．9ms，矩阵224×384，视野248mm×360mm；自由呼吸放射状K空间填充方式的容积内插体部检查（Radial volumetric interpolated breath－hold examination，Radial－VIBE）序列，层厚2．5mm，TR3．87ms，TE1．78ms，矩阵288×288，视野380mm×380mm；膈肌导航的应用刀锋采集技术的快速自旋回波T2WI（BLADE－TSE－T2WI）序列，层厚3mm，TR4029．08ms，TE97．00ms，矩阵256×256，视野240mm×240mm；扩散加权成像（DWI）序列，层厚5mm，TR5700．00ms，TE54．00ms，矩阵88×128，视野261mm×380mm，b值分别为50，700s／mm2。

3．磁共振图像处理及分析

由两名具有5年以上食管磁共振诊断经验的放射医师对MRI图像质量进行评分［16］，采用双盲法对术前MRI共同诊断，联合DWI、BLADE－TSE－T2WI及Radial－VIBE序列，在Neusoft PACS上ADC序列中选取肿瘤实性成分最多且面积最大的层面及其上下两个层面，避开肿瘤内坏死、囊变区域，所勾画ROI面积不低于肿瘤实性成分最大层面的90%，两名医师勾画时间间隔一周，最终以两名医师求得平均值作为最终结果（图1）。新辅助治疗患者，勾画和大体病理时间一致的治疗后MRI图像，以确保测量ADC值的准确性。ROI的面积为15～200mm2。

4．外周循环肿瘤细胞采集及处理

入组患者术前空腹采集5mL静脉血于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中，保存于4℃冰箱中，运用Can－Patrol CTCs分离富集技术，采用多重RNA标记间质细胞（vimentin和TWIST1）和上皮细胞（EpCAM和CK8／18／19）的特异性标志物以此将CTCs分为上皮型（E＋）、混合型（E＋／M＋）、间质型（M＋）［17－18］，分别表示为红色荧光、红色和绿色混合荧光、绿色荧光（图2）。

5．新辅助化疗方案

对于进展期可切除性食管鳞癌，采用紫杉醇＋奈达铂进行两周期新辅助化疗后重新评估后手术，化疗一周期时间为7天，化疗方案为：紫杉醇联合奈达铂，前三天静脉滴注奈达铂（30mg／m2），第1天及第7天静脉滴注紫杉醇（70mg／m2）；第一周期化疗结束后间隔两周后继续用相同化疗方案进行第二周期化疗，第二周期化疗结束两周后即进行术前食管MRI扫描。

6．病理结果

由两名高年资病理科医师采用双盲法按照世界卫生组织对食管癌手术病理结果进行分级，分为高分化（G1）、中分化（G2）、低分化（G3），低分化预后较中分化及高分化差［19］，并对肿瘤局部浸润及淋巴结转移进行分析。

7．统计学分析

采 用SPSS 21．0、MedCalc 18．11和GraphPad Prism 7软件进行统计分析。计量资料采用Shapiro－Wilk检验其正态性，服从正态分布的资料采用表示，不服从正态分布的资料采用中位数及四分位数间距表示。采用Bland－Altman分析两名磁共振诊断医师所得ADC值的一致性，并计算其组内相关系数（intraclass correlation coefficient，ICC）。采用Mann－Whitney U检验、Kruskal－Wallis H检验及独立样本t检验比较不同病理分级、不同病理T分期、病理N分期间ADC值、CTCs总数及各亚型数目的差异。采用Spearman秩相关分析比较病理分级与ADC值及CTCs值的相关性。采用受试者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线及曲线下面积（area under curve，AUC）评价ADC值、CTCs总数及其各亚型数目对低分化食管鳞癌的诊断及预测能力，采用Z检验比较有效参数AUC。以P＜0．05为差异具有统计学意义。

结 果

68例食管鳞癌患者中未经过任何治疗直接手术的42例，经过2周期新辅助化疗后手术者26例。病理结果显示高分化5例，中分化43例，低分化20例。两名磁共振诊断医师所得到ADC值组内相关性均较好，所得ICC值为0．877，P值＜0．001。两名医师分别对图像质量进行评分，一致性较好（表1）。

不同病理分级间ADC值、CTCs总数及M＋CTCs差异具有统计学意义（表2）。其中，ADC值与病理分级呈负相关（r＝－0．677，P＜0．001）；CTCs总数、M＋CTCs与病理分级均呈正相关（P均＜0．05），ADC值与CTCs各亚型之间无相关性（P＞0．05）。G1组M＋CTCs、CTCs总数低于G3组，G1组ADC值高于G3组，差异具有统计学意义（P均＜0．05）；G3组与G2组中M＋CTCs、ADC值差异具有统计学意义（P＜0．05）；G1与G2组CTCs总数及ADC值差异具有统计学意义（P＜0．05，图3）。

68例食管鳞癌患者ADC值、CTCs总数及各亚型数目在不同病理T分期、病理N分期、临床分期、肿瘤位置间差异无统计学意义（表2）。从ADC和CTCs亚型诊断低分化食管鳞癌的ROC曲线AUC可知，ADC（AUC＝0．870，P＜0．001）、M＋CTCs（AUC＝0．690，P＜0．05）对于诊断低分化食管鳞癌有一定的价值，CTCs总数诊断低分化食管鳞癌的效能差（P＞0．05）。采用Z检验比较AUC可知，ADC值诊断效能优于M＋CTCs（Z＝2．25，P＜0．05）。采用二元logistic回归分析联合ADC及M＋CTCs诊断低分化食管鳞癌的效能（AUC＝0．873，P＜0．001）优于单一因素诊断效能（表3，图4）。

表1 两名放射科医师图像质量评分表

表2 ADC及CTCs各类型组间差异性分析

表3 ADC和M＋CTCs联合因素和单一因素诊断效能Z检验

讨 论

1．ADC及CTCs对不同病理分级的诊断

本研究结果显示，肿瘤组织ADC值与病理分级呈正相关，CTCs值及亚型有效数目与病理分级呈负相关，差异具有统计学意义，术前ADC值联合间质型CTCs可以有效预测食管鳞癌的病理分级，为患者提供有效的个体化治疗方案。

本研究选取手术大病理结果为金标准，同时选取相同时间点的MRI及CTCs结果，确保了数据时间点的一致性。对于入组的新辅助治疗患者，新辅助治疗可以导致肿瘤细胞出现不同程度的核固缩、破裂，癌细胞不同程度的变性、坏死，从而使肿瘤的病理分期降级，肿瘤的病理分级也发生不同程度的变化。因此，对于新辅助治疗患者，本研究选取的为治疗后及术前的MRI进行ROI的勾画，确保了测量ADC的准确性，同时也确保了和手术大病理时间的一致性。

图1 男，44岁，胸中段食管鳞癌，中分化，侵及肌层，外膜 仍 然 连 续（T2）。a）BLADE－TSE－T2WI图 像，病变呈稍高信号（箭）；b）Radial－VIBE序 列 图 像，病变可见强化（箭）；c）DWI图像，病变呈高信号（箭）；d）ADC图像，病变呈低信号（箭）。 图2 食管鳞癌患者血样中上皮间质转化标志物表达。a）上皮型CTCs（E＋CTCs）；b）混合型CTCs（E＋／M＋CTCs）；c）间质型CTCs（M＋CTCs）。

图3 不同病理分级间各参数独立样本t检验、Mann－Whitney U检验结果。a）E＋CTCs组间结果；b）E＋／M＋CTCs组间结果；c）M＋CTCs组间结果；d）CTCs总数组间结果；e）ADC值组间结果。

本研究结果显示，肿瘤高、中分化组ADC值显著高于低分化组ADC值，差异具有统计学意义，肿瘤分化程度越低，ADC值越低，说明水分子扩散受限程度明显。分析原因可能为：肿瘤分化程度低，恶性程度高，肿瘤细胞异质性越明显，肿瘤细胞核质比增大，致使肿瘤细胞体积增大，细胞排列紧密，细胞外间隙减小，水分子扩散运动受限，相关ADC值减小。这与［14，20］以往研究结果一致，认为ADC值可以反应食管鳞癌及胃癌病理分化程度，其随着分化程度的增加相应ADC值增大。食管本身属于空腔脏器，且容易受邻近大血管及心脏搏动的影响，因此选择b值方面尤为重要。

图4 a）ADC值诊断低分化食管鳞癌交互式散点图；b）M＋CTCs诊断低分化食管鳞癌交互式散点图。

b值越高，DWI对肿瘤组织内水分子扩散越敏感，排除T2穿透效应的影响，更好的反应肿瘤的内部特征［21］。但是，b值越高，图像的信噪比会下降，对病变的检出敏感度下降。b值比较低时，图像分辨率较高，但是对水分子扩散的敏感性会下降［22］。因此本文选择b值为700s／mm2。以往的研究证明ADC值可以有效的预测食管癌的T分期及淋巴结转移情况［23，24］，但是本文结果与之不同，分析原因可能为，ADC值主要受细胞及细胞外结构的致密程度影响，但肿瘤的浸润深度，转移情况还受肿瘤细胞结构、细胞形态、代谢生化等多种混合因素影响，因此结果存在一定的偏差［25］；另外，文献报道ADC值之间差异较大，可能受MRI的型号、磁场强度的影响，还会受肿瘤周围组织的影响［26］。本研究结果中进展期食管癌病变较大，内部肿瘤实性成分结构相对混杂，可能混合有肉眼无法辨别的小坏死及纤维结构，因此ADC值相对较高。

本研究结果显示CTCs总数及间质型CTCs与肿瘤病理分级相关，高分化组CTCs值显著低于中／低分化值CTCs，肿瘤分化程度越高，恶性程度越低，相应CTCs值越少，预后越好。这与刘涛等［15］研究结果一致，其研究证明CTCs数目与食管鳞癌肿瘤分化程度，浸润深度，淋巴结转移显著相关。说明食管癌外周循环肿瘤细胞数量可以在一定程度上反应肿瘤细胞的进展程度，通常来说，疾病治疗效果欠佳或疾病治疗后处于进展状态，外周血循环肿瘤细胞数量将会增多［27］，患者预后将会变差。目前也有研究结果表明CTCs在乳腺癌、结直肠癌等肿瘤中在肿瘤微转移、预后检测有重要的意义，可能是监测肿瘤复发和转移的潜在替代标志物，最新NCCN乳腺癌指南（2017．V3）已将CTCs纳入TNM分期系统［28－30］。因此动态监测外周循环肿瘤细胞，可以在肿瘤播散前，及时调整个体治疗方案，以此来改善肿瘤患者预后效果。

2．ADC及CTCs对低分化食管鳞癌诊断效能

本研究结果显示，肿瘤病变区ADC＞1．711×10－3mm2／s时，其诊断非低分化食管鳞癌的效能优于间质型CTCs，可见DWI可以在分子水平上更早的显示肿瘤组织的超微结果。本文采用CanPatrolTM CTC－二代富集技术分离富集CTCs，采用RNA－ISH技术将CTCs精确分型，根据ROC结果分析可知，间质型CTCs诊断低分化食管鳞癌的效能较好。这与以往学者证明的间质型CTCs与肿瘤的预后和转移密切相关［31，32］，Han等［33］也认为，间质型CTCs及混合型CTCs是食管癌预后的重要指标。本研究联合ADC值及间质型CTCs诊断低分化食管鳞癌效能优于单一因素诊断效能，王准等［34］也研究了，食管癌DWI与食管癌组织Sirtuin1（SIRT1）蛋白表达相关，其两者可以有效预测食管癌的辐射抵抗。将影像结果和临床结果相结合，更准确的预测食管鳞癌的病理分级，有效指导临床治疗。

3．本研究的局限性

第一，在世界范围内食管癌主要类型是食管鳞癌，然而现在欧美国家食管腺癌发病率逐渐超过食管鳞癌［1］，我国主要病理类型为食管鳞癌，因此入组患者选择食管鳞癌，未选择食管腺癌或者其他类型食管癌。第二，由于入组患者均需手术获得病理结果，而且同时需具有CTCs检测结果，对于无法进行手术者则不能归入；而且CTCs检测及食管MRI检查目前尚不是食管癌常规检查手段，因此纳入病例只有68例，各组病理分级样本相对较少。第三，DWI可以定量区分肿瘤实性组织和肿瘤组织中的坏死部分，但是图像容易受b值影响，因此本研究选择b为700s／mm2，且入组数据均经过图像质量评估，勾画ROI时结合了BLADETSE－T2WI及radial－VIBE序列，有效的提高了ROI勾画的准确性。

综上所述，ADC、M＋CTCs与食管鳞癌的病理分级相关，且ADC值诊断效能优于M＋CTCs诊断效能，两者之间是独立不相关的；联合两者有效因素诊断诊断效能更佳。