兽药检测技术研究进展

文│刘妍璨 刘智 代跃沣（云南省昭通市畜牧兽医技术推广站）

近年来，由于假冒兽药技术越来越先进，同时也越来越复杂，假冒兽药产品和不合格产品呈现上升趋势。某些伪造假冒的兽药产品质量可能符合兽药典规范的要求，也就是说，它们的有效成分含量是符合标准的。世界卫生组织（WHO）将假冒药品定义为故意在身份或者来源方面贴错标签的药品，假冒产品既可能是品牌产品，也可能是假冒伪劣产品，包括：具有有效成分或者其他成分的药品；不含有效成分或者含量不足的伪劣产品；仿冒的假冒产品。尽管某些假冒兽药包含正确的有效成分，但在制造过程中未遵循生产规范（GMP）和其他规范，存在安全隐患。在需要使用抗菌药物时，使用抗菌药物含量较低的假冒伪劣药品，会因为亚治疗剂量而使微生物产生耐药性。

当前识别假冒兽药的方法主要包括视觉分析和化学分析。药品和包装中包含的防伪标志可用于视觉分析。一些公司建议使用特殊的墨水和印刷技术将独特的设计、编号或图标直接压印到产品上。美国食品药品监督管理局（FDA）开发并使用了一种便携式技术，该技术基于使用多波长光源对假冒产品进行可视化分析。化学分析方法包括比色法、液相色谱—质谱、近红外光谱、近红外化学成像、中红外光谱、拉曼光谱、X射线荧光、X射线粉末衍射、离子迁移谱和同位素比质谱。然而，这些分析方法中有些比较费时或准确度不高。

在本篇综述中，笔者重点介绍了几种快速检测药物的技术，这些技术最近已被报道用于假冒伪劣兽药的定性和定量。此外，讨论了假冒伪劣兽药的一些新特性，并给出了处理此类假冒产品的几个示例。

一、光谱法

1.近红外光谱。近红外光谱（NIRS）是一种快速且准确率高的技术，可对几乎任何基质进行多成分分析。它覆盖了与中红外光相邻的波长范围，并一直延伸到可见光区域。尽管在20世纪20年代初进行了许多NIRS实验，但直到20世纪60年代中后期才实际使用NIRS。近年来，NIRS已在制药行业中被广泛接受，用于原料测试、产品质量控制和过程监控。由于NIRS与其他分析技术相比，主要优势是无须任何预处理即可轻松进行样品快速分析，NIRS已被用作一种防伪分析方法。Scafi等人通过使用NIRS，建立了相对简单的协议，并采用了化学计量学方法（主要成分分析和比对的软独立模型），以此来识别假冒药品。他们评估了与使用NIRS进行药物识别有关的主要缺点，例如湿度变化，样品位置和样品表面（用于片剂）。此外，他们提出一种简单的方案，并做了验证，可以使用已知的假冒药品来做成对比检测的可靠模型。Olsen等人使用百忧解作为模型药物来证明NIRS在筛查假冒药物方面的灵活性。Vredenbregt等人描述了一种使用NIRS的快速筛选方法，用于检测假冒仿制西地那芬的产品，从形状、颜色看起来像西地那芬的未知样品中，他们开发出的方法很容易将44个样品鉴定为假药。

在国内，为了快速检测出伪劣假冒药品，相关部门正在研究开发移动实验室，主要用于药物筛查测试领域。正在开发包括安装在移动车辆中的NIRS测试系统的“快速药物识别系统”。Feng等人选择了来自不同制造商的罗红霉素片和红霉素乙基琥珀酸酯片构建通用定量模型（可用于测试具有相同含量和相同规格但来自不同制造商的药物产品的模型），以用于NIRS预筛选系统的示例，模型具有良好的特异性及线性，准确性和重复性高。此外，它们无须任何特殊的数学处理即可直接用于同一品牌的不同光谱仪中。近年来，中医研究人员对NIRS的热度不减。该技术可用于中药的药用种类鉴定、分类、来源分析以及掺假检测等。

2.近红外化学成像。近红外化学成像（NIR-CI）结合了经典光谱技术，能够提供有关药品成分的空间化学结构信息。因此，NIR-CI已成功应用于药物鉴定和量化，也可用于测定制造工艺对药品的影响，以及评估药品的均匀性。Dubois和Wolff等人已使用NIR-CI来鉴定假冒药品。Puchert等人提出了一个新的四阶段概念，用于可靠地识别与真实产品非常相似的假冒兽药。他们发现，对于伪造品鉴定，NIR-CI优于单点NIRS，因为它结合了光谱学的功能和可视化的潜力，从而可以对化学成分、域结构和化学结构进行局部表征。Lopes等人采用NIR-CI来研究未知来源的仿冒片的成分，得出的结论是，在不了解片剂的任何信息且不破坏片剂的情况下，NIR-CI能够在空间上鉴定和量化假冒片剂研究中的主要化合物。

3.拉曼光谱。拉曼光谱法是利用非弹性散射光获得样品的光谱“指纹”，然后可以根据峰的位置和强度来鉴定组分及其相对浓度。像NIRS一样，拉曼光谱仪作为便携式设备已被证明在现场鉴定和伪造品检测上很成功。无须任何样品前处理，拉曼光谱仪就可以透过包装进行无创性和非破坏性筛查。随着这种光谱技术的发展，便携式拉曼光谱变得越来越流行。

Noonan等人研究一种检测的通用模型，该模型可以在三种制剂存在的情况下对多种目标药物进行分类，其中某些化学成分与目标药物非常相似。在开发的模型基础上，他们能够成功地将相似的药物进行快速分类，并详细介绍了如何使用自制的手持式商用仪器来采集光谱，以及在模型开发之前对所需光谱进行预处理。Loethen等人使用了一种方法，该方法仅使用药物有效成分的拉曼光谱作为参考库，就可以在广泛的抗感染类药物中快速完成仿照品的筛选。申炳俊等人已经开发了一种使用便携式拉曼光谱仪的方法，可无损地筛选人血清白蛋白注射剂。Lawson和Rodriguez提出了一种使用拉曼光谱法筛选抗生素和抗病毒药物成品的新算法，该方法引入了二进制条形码比较方法来识别药品中的有效成分，结果表明，该方法可以正确预测18种不同商业药品和9种模仿假冒药品。

4.X 射线荧光。X 射线荧光（XRF）是确定物质中微量元素的种类和含量的一种技术。该技术具有多元素分析能力强、灵敏度高、精度高、分析时间短等优点，并且无损检测。这些功能使其适合检测各类兽药，是一种出色的分析方法，可用于测定有效成分、涂层剂和赋形剂，例如磷酸钙、氧化钛和氧化铁，所有这些辅料都可以通过XRF直接在表面上进行检测。Ortizaet等研究人员从XRF数据中提取获得了多个商业样品和假冒样品的无机化学指纹，并使用化学计量学方法将所研究的药片归类为真品或伪造品。因此，XRF为有效成分和赋形剂的半定量测定提供了一种极好的分析方法。

5.X射线衍射。粉末X射线衍射（PXRD）在制药工业中通常用于中间产品药物有效成分的多晶型鉴定，但不适用于最终产品。Maurin等人展示了对真实和假冒西地那芬的分析结果，显示了辅料及其丸芯的差异，除了去除外包装外，药物未进行任何事先处理，从西地那芬制假样品获得的结果表明，X射线粉末衍射，特别是在使用新型快速衍射技术（包括多层镜和位置敏感计数器）非常适合用于兽药市场对假药的筛查控制。有研究表明一种基于微X射线衍射的防伪方法，使用扫描的X射线束还可以读取条形码和商标，其分辨率可达到0.30毫米，可以通过X射线衍射读取。已获批文的兽药（包括氟苯尼考和头孢噻呋）条形码和商标印在各种基材上证明了X射线衍射方法是非破坏性的、自动化的且人性化的，可用于通过印在制剂包衣上或包装上的隐藏图案来验证药物制剂的真实性。

6.红外光谱。Anzanello等人提出了一种方法，用衰减全反射傅立叶变换红外光谱（ATR-FTIR）波数子集，鉴别两个兽药制剂样本，其中一个为真品另一个为假冒产品，该方法首先将多元技术PCA应用于ATRFTIR数据，并且从PCA提供的参数中得到可辨真伪的重要性指数。

二、色谱方法

色谱方法不仅可以用于实验室，而且可以用于快速检测假冒兽药或者是兽药中的非法添加。朱俐等人开发了一种在20分钟内快速测定14种兽药抗生素的高效液相色谱（HPLC）方法，该方法使用二极管阵列检测器和C18或C8色谱柱，通过该方法仅需少量参考标准品即可进行定量分析。有研究报道，一种新开发的低成本毛细管电泳（CE）仪器进行定性定量分析，在他们的试验中，对已知假冒抗菌、抗寄生虫兽药等有针对性的药理学类别进行了完整的验证研究。尽管有高效而又有针对性的定性定量色谱技术，如HPLC、CE等，但是样品前处理可能会很耗时，常用几种样品前处理技术包括固相萃取、固相微萃取、液相微萃取、微波辅助萃取和超声辅助萃取等。

三、质谱

1.同位素比质谱。同位素比质谱仪（EA-IRMS）是用于测量批量样品中稳定同位素量比的常规仪器，它已广泛用于现实研究，以建立追溯食品药品来源的方法。碳和氮的测量可提供有关植物类型日粮的信息，而氢、氧和硫的数据可提供可靠的环境和地理信息。Jasper等人研究发现使用IRMS进行有效成分定量研究，在这项研究中，选择了含有四种有效成分的20个盲样，并测量了碳、氮、氧或氢元素的同位素含量比。

Benson和Carter等人总结了同位素比数据在分析假冒兽药中的用途。Fernandez等人对80批次的生鲜牛奶中抗生素和激素残留进行了广泛研究。由于牛奶的激素及抗生素包含碳、氮和硫元素，因此通过多收集器电感耦合等离子体质谱（MC-ICP-MS）和EA-IRMS对这些元素的同位素量比测量进行了分析。结果表明，两种方法的结合具有检测仿冒药品的巨大潜力。此外，这种方法可以使将两个假冒批次联系起来，查到共有的源头，或者在生产一系列假冒兽药的嫌疑人与负责生产假冒兽药制剂的实验室之间建立联系。

2.离子迁移质谱。离子迁移谱（IMS）是一种分析技术，可根据其离子迁移率将气相离子分离，这与分子结构、大小和形状有关，类似于凝聚相中的电泳。长期以来，该技术一直用于检测药品中非法添加物质。最初，离子迁移谱仪仅用于物理化学领域和等离子体物理研究。在20世纪80年代后期，基质辅助激光解吸和电离（MALDI）和电喷雾电离（ESI）方法的发展使IMS能够测量大型生物分子，使得20世纪90年代离子淌度质谱（IM-MS）领域有了重大突破。Gryniewiczet等人发现IMS是通过西地那非、他达拉非等5种已知类似物掺假药进行分析，建立了有用的快速筛选方法。芒斯等人扩展了IMS的检测范围，包括以前未经测试的西地那非类似物和最近批准的阿伐那非，研究表明，IMS可以用作一种快速筛选工具，用于检测有效成分总的掺杂物。Krueger等人使用高性能离子迁移谱仪对营养补充剂进行快速分析。哈里斯等人应用漂移管离子迁移谱法（DTIMS）结合激光烧蚀/解吸电喷雾电离（LADESI）来对现场收集的抗疟药物片剂进行指纹识别，LADESI平台提供了用于识别药物有效成分的独特光谱功能。

离子淌度质谱（IM-MS）是一种强大的分析技术，结合了传统上与IMS和MS相关的优势。IM-MS已应用于糖、肽、脂质、蛋白质、核苷酸以及其代谢产物的测定。它可以用于增强化学和生物物理分析的各个领域。Cuyckenset等人专注于研究IM-MS，它与体内电荷状态过滤和各种现有软件工具结合使用，用于在体内基质存在下提取和鉴定肽类药物的代谢产物的离子。Blackburn等人在动物血浆中二苯胺碱的生物分析中引入了波形迁移率光谱法（FAIMS）。尽管到目前为止，只有少数报道通过IM-MS快速检测假冒兽药，但是这种强大的技术很可能在将来变得流行。

3.气相色谱—质谱。气相色谱—质谱（GC-MS）是定性和定量药物中未知掺杂物灵敏有效的技术，它可以应用于中兽药掺假化药的检测。朱小红等人开发了GC-MS方法来检测兽用中药中的非法添加化药。

4 . 其他质谱检测技术。Fernandez等人通过解吸电喷雾电离（DESI）和实时直接分析（DART）结合飞行时间质谱对假冒兽药进行了分析研究，他们证明了DART在快速筛查假冒抗疟疾药物，筛查出青蒿琥酯几种不同假冒产品的实用性，这些假冒产品中有些含有其他无效成分，一个假冒品含有青蒿琥酯，但仅占规定含量的20%，这对疟疾控制具有重要意义，因为使用低剂量青蒿琥酯可能导致疟疾寄生虫中出现青蒿琥酯耐药性，从而使青蒿琥酯无效。

四、结论

随着假冒技术的不断发展，假冒兽药已成为正规兽药行业及畜禽养殖业主要威胁。特别是在发展中国家，假冒伪劣、非法添加兽药的新特性发展趋势日益复杂，包括：符合《兽药典》的产品（即假冒兽药产品可以通过指定检测）；将化学药品掺入传统中药中；使用回收的正规包装的假冒兽药。为了应对复杂且不断变化的情况，仅使用一种检测技术是无法获得令人满意的结果。

某假冒疫苗在流动实验室中进行了测试。通过视觉分析，包装盒、上部密封贴纸、装有药物的瓶子是真实的。但是，在紫外光和目视检查下发现，下部密封胶、塑料盖和铝盖是伪造的。通过NIRS和HPLC-MS进行了进一步测试，证明该疫苗为假冒疫苗。通过这种检测技术的组合，可以快速正确地识别出假冒疫苗。

光谱方法，特别是NIRS，在检测假药中非常实用。经过10 年的实施，我国逐步开发了快速的NIRS药物筛选系统，已成为NIRS在国内应用的主要平台。通过快速初步筛选鉴定出可疑药物后，可通过HPLC或LC-MS进行进一步分析以进行验证。通常，本文中介绍的所有检测技术均采用数据库比较。通过将测试结果与相关数据库进行比较，可以实现快速分析，这些数据库的广泛共享和应用将加速快速检测技术的实施，兽药监管体系也可借鉴此模式，使兽药监管更加高效准确。