西瓜枯萎病抗性鉴定技术方案

闫闻 王喜庆 贾云鹤 付永凯 尤海波

摘    要： 西瓜是我国重要的葫芦科经济作物，西瓜枯萎病是真菌性土传病害，在西瓜整个生长期均可发生，已严重影响到我国西瓜产业的可持续发展。笔者根据已有研究成果，对西瓜枯萎病的危害症状、病原菌分离鉴定及培养、人工接种鉴定技术、自然病圃鉴定等作了描述和规定，形成了适宜于西瓜枯萎病抗性鉴定的技术方案。

关键词： 西瓜;枯萎病;人工接种;自然病圃;鉴定标准;技术方案

中图分类号：S651  文献标志码：B  文章编号：1673-2871（2020）01-076-03

西瓜是一种重要的葫芦科园艺作物，每年全球西瓜种植面积约350万hm2，总产量约 10 000万t[1]。我国是最大的西瓜生产和消费国，每年西瓜的种植面积约180万hm2，总产量约 7 000 万t（http：//faostat.fao.org）。西瓜在我国农业结构调整和农民增收中发挥着重要的作用。

西瓜枯萎病是由西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. niveum）侵染引起的一种在世界范围内广泛发生的真菌土传病害[2]，主要通过土壤传播，也可由种子传播，严重危害西瓜生产，导致西瓜产量严重下降甚至绝产[3]。目前，西瓜枯萎病菌有4个生理小种：生理小种0，1，2和3，不同的生理小种可通过特定的鉴别寄主鉴定[4]。抗病品种选育是防治枯萎病危害的经济有效的途径。基于此，笔者根据西瓜枯萎病的生物学特征，结合已有的研究基础制定了西瓜枯萎病抗性鉴定技术方案，该方案经多次应用验证，适合于西瓜枯萎病的抗性鉴定，为抗病种质的筛选提供可靠的参考依据。

1 西瓜枯萎病病害症状

西瓜枯萎病在全生育期均可发病，在幼苗期发病较少，幼苗出土后，主要表现为茎基部变褐缢缩，子叶萎蔫下垂，幼苗猝倒，而后干枯死亡。多数病株从伸蔓期至果实膨大期发病，萎蔫枯萎是田间的典型症状，病株叶片自下而上逐渐萎蔫，似缺水状，病情发展缓慢时，植株午间萎蔫，晚上逐渐恢复，几次反复后病株不再恢复常态，萎蔫枯死，叶片不脱落，病情发展迅速时，叶片和茎蔓可突然由下而上全部萎蔫。病株的根部变褐腐烂，容易拔起，茎基部常纵裂，裂口处有褐色胶状物，剖视病蔓基部，可见维管束变为褐色。在潮湿条件下，病部可产生白色或粉红色霉状物。在团棵期，部分病株表现为植株生长缓慢、苗小、蔓细和叶瘦小发黄，茎部维管束变褐，雨后常出现裂茎，植株为畸形的小老苗[5-6]。

2 西瓜枯萎病病原菌的分离与鉴定

2.1 病原菌分离纯化

采用组织分离法分离病原菌[7]。在西瓜枯萎病发生地块，采集西瓜病株茎基部组织，2～3 cm，流水冲洗，用 75%乙醇消毒 30 s，用无菌水清洗 3～5 次，去除茎表皮，切成1～2 mm薄片，轻轻按压贴于 PDA 培养基（马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉 15 g、蒸馏水 1 L）表面，25 ℃，恒温条件下培养 3～5 d，长出真菌菌落后挑取边缘菌丝再进一步纯化。若无其它杂菌，扩繁后则可制备孢子悬浮液。

西瓜枯萎病菌孢子悬浮液制备方法：在固体培养基上挑取 1个 0.5 cm2 菌片放入200 mL PL培养基（配方为：1 000 mL 水，马铃薯 200 g，乳糖 20 g）中，于摇床中 25 ℃、110 r·min-1 培养 5～7 d，将菌液用灭菌的4层纱布过滤，用血球计数板记数并调整孢子浓度为5×106个·mL-1。

2.2 病原菌鉴定

形态学特征：病原菌在 PDA 培养基上呈白色菌丝、随着生长中间呈粉红色、淡红色、淡紫色、紫红色等，菌落圆形，菌丝绒毛状（图1-A）。大型分生孢子为镰刀型，有 3～5个分隔，以3个分隔为主（图1-B）[10];小型分生孢子，椭圆形，0～1个分隔，以无隔为主（图1-C）;分生孢子梗短、生于菌丝侧面，单生，无分枝;厚垣孢子顶生或间生，圆形，多为单独生长，偶尔也对生或串生[8-10]。

分子生物学鉴定：将病原菌接种于PL液体培养基，在25 ℃、110 r·min-1条件下振荡培养3～4 d，过滤收集菌丝体，按照真菌基因组DNA提取试剂盒提取病原菌DNA，用真菌通用引物ITS1/ITS4（ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4：TCCT

CCGCTTATTGATATGC）对病原菌 rDNA 的 ITS 区域进行 PCR 扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后回收、测序，将该序列提交至 GenBank，通过 BLAST进行序列比对，分析待检菌株与Fusarium oxysporum同源性[10]。

病原菌回接试验：确保分离的菌是西瓜枯萎病病原菌，完成柯赫氏法则。

生理小种鉴定：西瓜枯萎病菌生理小種鉴定采用Sugar Baby（或 Black Diamond），Charleston Gray，Calhoun Gray 和 PI296341-FR 作为一套鉴别寄主，生理小种划分标准见表 1[4]，接种鉴定技术详见枯萎病苗期人工接种鉴定：

3 西瓜枯萎病苗期人工接种鉴定

3.1 接种方法

3.1.1 壮苗培养 西瓜种子消毒催芽，1.5 %次氯酸钠溶液消毒20 min，中间翻动1次，消毒结束后用流水冲洗干净，浸种12 h，用湿毛巾包好在30 ℃恒温箱中催芽，当80%以上的种子出芽时播种。在育苗盘中装入灭菌的蛭石，浇透水，播种后用蛭石覆盖，并盖薄膜保温保湿。出苗后白天温度控制在24～28 ℃，夜温在18 ℃度左右，防止徒长。

3.1.2 采用浸根法接种 孢子液浸根法接种，植株发病迅速、均匀，可缩短西瓜枯萎病的病程 [11-12] 。菌液的孢子浓度为5×106个·mL-1，待鉴定的不同西瓜种质幼苗以 25～30 株幼苗为 1 组，重复 3 次，接种前按苗数准备营养钵，装入高温灭菌的草炭土。播种后8～10 d，2片子叶平展时接种，接种在遮阴条件下进行，选取长势一致的幼苗从蛭石中取出，根系轻度损伤，洗净根部，在准备好的孢子液中浸根15 min，保持根系全部浸入，中间摇动2～3次，防止孢子沉降。浸根接种后，幼苗移栽至营养钵中。

3.1.3 接种后的植株培养 接种后前3 d保持遮阴，温度保持在24～30 ℃，3 d缓苗后撤掉遮阳网，剔除不正常的苗子，自然光照条件下培养。

3.2 鉴定标准

感病寄主在接种后5～10 d发病，记录寄主的生长和发病状况，接种后15～21 d，调查病情指数，植株被定为0～5级，接种后症状见图2[13]： 0级，无症状;1级，晴天中午子叶萎蔫或部分子叶、真叶轻微萎蔫;2级， 1片真叶萎蔫或子叶较重萎蔫;3级，子叶及真叶萎蔫，阻碍发育;4级，整株萎蔫，60%以上枯死，心叶成活;5级，整株严重萎蔫并枯死[13]。

抗性分级，以病株率进行评价：病株率≤20%为高抗：病株率21%～50%为中抗;病株率51%～80%为轻抗;病株率>80%为感病 [4] 。

病情指数=（∑（各级株数×发病级数）/总株数）×最高病级×100。

病株率/%=发病植株之和（株）/调查总株数（株）×100。

4 西瓜枯萎病自然病圃鉴定

自然病圃为西瓜连作地，土壤中西瓜枯萎病菌数量在1×104～1×105 cfu·g-1。待鉴定西瓜种质常规方法育苗，2叶1心定植于病圃大棚内，10株1组，设3 次重复，植株伸蔓后开始进行发病率统计，直至收瓜后结束调查。调查时，按照0～3级病情分级标准，逐株记录发病情况，其中0级：健株，长势良好无病症;l 级：病株叶片自下而上逐渐萎蔫，似缺水状，中午更为明显，早晚尚能恢复;2级：病株叶片萎蔫，不能再恢复正常;3级：整株叶片呈发黄枯萎下垂，不能再恢复正常，叶片枯黄至全株死亡。病情指数和发病率计算公式、抗性分级标准同3.2。

5 小 结

苗期人工接种结合自然病圃鉴定结果，可全面的分析待鉴定西瓜种质对枯萎病的抗性情况，有助于枯萎病抗性种质资源的筛选和新品种抗病性评价。

本文所述技术方案对西瓜枯萎病的病害症状和病原菌的鉴定方法进行了详细描述，同时对苗期接种和自然病圃鉴定方法及抗病鉴定指标进行系统性规范。该技术方案的制定，将为枯萎病抗性种质资源的筛选和新品种抗病性评价提供技术指导。

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