利用SSR技术鉴定西瓜甜瓜种子纯度

何玉 杨坤

摘 要：利用SSR分子标记技术对西瓜‘W1806与甜瓜‘M1805各3个批次及其亲本间的多态性进行引物筛选和种子的纯度鉴定。结果表明，在28对西瓜的SSR引物中，有5对引物在西瓜‘W1806的F1代与亲本之间有很好的多态性。其中BVWS00839引物特异性好，条带清晰，父母本条带间隔明显，即作为3个批次的西瓜纯度鉴定的引物，其鉴定纯度分别为99.47%、98.96%和97.92%;在18对甜瓜的SSR引物中，只有1对CMBR052引物在F1代扩出的条带为典型的双亲互补型条带，故用该引物对甜瓜进行纯度鉴定，其纯度分别为97.90%、96.80%和97.40%。与田间鉴定结果的吻合率都在98%以上。这2个材料的吻合率说明SSR分子标记技术对西瓜和甜瓜纯度鉴定结果都是可靠的。

关键词：西瓜;甜瓜;SSR分子标记;纯度鉴定

中图分类号：S651   文献标志码：A   文章编号：1673-2871（2020）01-013-05

Abstract： The polymorphisms between three batches of watermelon W1806 and melon M1805 and their parents were screened by SSR and the purity of seeds was identified. The results showed that there were five pairs of primers in the SSR primers of 28 pairs of watermelons， which had a good polymorphism between the F1 generation of watermelon W1806 and its parents. Among them， BVWS00839 primer has specific specificity and clear band， which is the primer for the purity identification of three batches of watermelon. The identification results were 99.47%， 98.96% and 97.92% respectively. In the 18 pairs of melon SSR primers， 1 pair of CMBR052 primers were expanded in F1 generation. The band is a typical parental complementary strip， so the primers were used to identify the purity of the three batches of melon， and the results were 97.90%， 96.80% and 97.40%， respectively. The coincidence rate with the results of field identification was above 98%， suggesting that the SSR molecular marker technology is reliable for the purity identification of watermelon and melon.

Key words： Watermelon; Melon; SSR molecular marking; Purity test

甜瓜是一種形态多样的异交种，在世界范围内具有重要的经济意义，在我国瓜类传统上由水果表皮特征（即网状和厚度）和烹饪用途来定义。因此，栽培的甜瓜种类分为4组：非网状厚皮甜瓜、网状厚皮甜瓜、薄皮甜瓜和薄皮蔬菜甜瓜[1]。我国中期作物遗传资源基因库共收集并保存了1 244份甜瓜种质资源，其中包括374份来自中国的甜瓜地方品种。甜瓜种质遗传变异的评价和开发对甜瓜的保护和遗传改良至关重要。中国目前是最大的西瓜生产国，据全国城市农贸中心联合会统计的数据显示，2018年约有7 000万t左右的西瓜在国内消化，平均每个人消费了50 kg的西瓜，西瓜也因此登上了2018年全国水果销量排行榜首位[2]。如今每年有大量的品种正在被商业化，西瓜品种的遗传多样性也变得越来越低。基于西瓜甜瓜遗传多样性和品种鉴定的需求，已经采用了许多方法来评估西瓜甜瓜的遗传多样性，从形态学标记到随机基因组DNA标记，如RAPD、SRAP和SSR[3-5]。

现如今，随着分子标记技术的成熟，这些分子技术已运用到西瓜甜瓜种子的纯度检测上。韩宏伟等[6]利用SRAP分子标记技术筛选出能够快速检测西瓜‘早佳（84-24）杂交种子纯度。RAPD是采用合成的较短的单个随机引物对基因组DNA进行PCR扩增，具有简单、准确和灵敏度高等特点[7]。刘富中等[8]通过优化RAPD的PCR体系，选出合适的引物对3个甜瓜杂交种进行纯度鉴定。随着西瓜基因组测序与重测序的完成[9]，人们发现SSR广泛分布于西瓜基因组中。孙波等[10]利用SSR分子标记技术对‘雪龙三号西瓜及其亲本间的多态性进行了引物筛选和种子纯度研究，并且结合与田间鉴定结果的吻合度证实其结果的可靠性。

在中国，种植户和西瓜育种者在引进不同地理区域的新种质以增强西瓜遗传多样性方面的兴趣日益增加。遗传变异和种质管理的传统评估基于一组形态描述符，然而这些形态描述符容易受到限制。此外，许多现代品种和杂种在表型上不太明显，使得形态学评价更加困难。通常很难仅根据其形态特征对200多个种质进行分类，因此必须开发可靠的方法，以便评估遗传多样性和品种鉴定[11]。SSR的技术特点在于其位点由一组不断重复的核心序列组成，核心序列可以是11～60个碱基对的重复序列[12]，构成重复序列的两端往往是趋于保守的限制性内切酶的切点，因此，内切片段的长度与核心序列单位长度成正比。在不同类别的分子标记中，SSR分子技术因其可重复性、多等位性、共显性遗传和良好的基因组覆盖而被选用于多种应用[13]，该技术的应用对未来种子的纯度鉴定有着实质性进步。

西瓜‘W1806是鲜食杂交中早熟品种，其生长势稳健，抗病抗逆性强，生态适应性广，易坐果，产量高而稳定，品质优良。甜瓜品种‘M1805肉质酥脆，香味浓郁，口感较好，田间表现中抗白粉病、霜霉病，耐低温弱光和高温高湿能力强，易栽培。这两个材料具有很高的推广价值，也深受广大群众的喜爱。人们对种子的品质要求越来越高，利用SSR分子标记对这两种材料进行快速、准确的纯度鉴定，不仅能够缩短鉴定周期，而且可以保证销售种子的品质，保障瓜农的利益。

1 材料与方法

1.1 材料

‘W1806和‘M1805由安徽荃银高科瓜菜种子有限公司收购自不同批次的种子，各选择3份，种子的亲本由上述公司科研部提供。

1.2 基因检测方法

1.2.1 催芽及装样 首先对种子进行随机取样，各取250粒，放入温水中浸泡3 h，最后用毛巾包裹放入恒温箱中36 h便可长出幼芽。用镊子将幼芽装入96孔深孔板中，每个品种需要装192粒即2个深孔板，最后放入-80 ℃中冷藏至少1 h。

1.2.2 DNA提取 采用SDS提取法[14]，該方法提取的DNA质量高，储藏时间较长。‘W1806‘M1805各3批提取192粒种子的DNA储藏于4 ℃冰箱中。

1.2.3 SSR-PCR反应体系 西瓜的引物来源于由李超汉等[15]发表的28对西瓜SSR引物。甜瓜的引物来源于宋海斌等[16]利用20份具有代表性的甜瓜从1 219对SSR引物中筛选出的18对核心引物。PCR扩增反应体系与扩增程序参照王慧等[17]撰写的西瓜专利。

1.2.4 8%聚丙烯酰胺凝胶电泳并银染显色 参考王慧等[17]的方法，其中将PCR扩增产物对应点入孔内，一般情况下正常使用小梳子51孔和大梳子40孔两种。

1.2.5 SSR分子标记纯度鉴定与田间纯度鉴定结果的比较 田间纯度结果由科研人员于2018年9月至2019年2月在海南种植，通过观察株形、坐瓜节位、果形等形态指标检测得到。在安徽荃银高科股份有限公司总部实验室利用SSR特异引物对同一批次的种子进行纯度鉴定。室内检测纯度结果与田间检测纯度结果吻合率（%）=室内结果/田间结果×100。

2 结果与分析

2.1 西瓜与甜瓜SSR特异性引物的筛选

将‘W1806及其亲本条带进行比较，一般选择多态性好、F1代具有双亲互补的带型、容易与其他混杂种子分辨出来的引物。其中BVWS00233、BVWS00314、BVWS00369、BVWS00839和BVWS02433这5对引物在F1代与亲本之间有很好的多态性。由于BVWS00839引物父母本条带间隔明显、多态性好、条带较为清晰，能够清楚分辨F1代的互补带型，故选择BVWS00839引物做纯度鉴定。对‘M1805及其亲本进行筛选，其中CMBR052引物在F1代扩出的条带一条来自父本，一条来自母本，为典型的双亲互补型条带，且条带较为清晰，故可用于‘M1805的纯度鉴定（图1～2）。

2.2 利用SSR分子标记对‘W1806进行纯度鉴定

分别从西瓜‘W1806种子的3个批次W1806-066、W1806-071、W1806-073中各检测192粒种子，其有效检测数分别是189、192、192粒（表1）。这3个批次的种子SSR纯度鉴定的电泳图如图3～5，其中W1806-066中有1粒种子扩出的条带与母本相同，为母本自交株，其纯度为99.47%;W1806-071中有2粒种子扩出的条带与母本相同，其纯度为98.96%。W1806-073中有3粒种子扩出与母本相同，1粒种子扩出的条带与父本相同，一般品种不纯主要由母本自交引起，与父本相同可能是收种时混入的掺杂个体，其纯度为97.92%。

2.3 利用SSR分子标记对‘M1805进行纯度鉴定

分别从‘M1805种子的3个批次M1805-003、M1805-004、M1805-006中检测192粒种子，其有效检测数分别是190、187、189粒（表2）。这3个批次的种子进行纯度鉴定的电泳图如图6～8，其中，图6和图7是用小梳子点样的，图6有4粒种子与父本扩出的条带相同，其纯度为97.9%。图7有3粒种子扩出的条带与母本相同，2粒与父本相同，1粒种子扩出的条带与父母本均不同，完全不同的这一粒种子有可能是掺杂的外来种子，该甜瓜的纯度结果为96.8%。图8有2粒与母本相同，3粒与父本相同，其纯度为97.4%。从分析的结果来看，该批次甜瓜不仅在授粉前母本去雄不彻底，而且还飞入了其他父本的花粉或混杂其他品种的种子。

2.4 SSR分子标记的纯度鉴定与田间纯度鉴定结果的比较

通过观测株形、坐瓜节位、果形等形态指标，西瓜W1806-066、W1806-071和W1806-073三个批次的田间鉴定纯度结果分别为100%、100%和99.24%（表1）。SSR鉴定结果与田间纯度鉴定结果的吻合率在98%以上。甜瓜M1805-003、M1805-004和M1805-006三个批次的田间鉴定结果分别为100%、98.29%和99.09%（表2）。SSR鉴定结果与田间纯度鉴定结果的吻合率也在98%以上。

3 讨论与结论

现如今，人们大多是采取去雄人工授粉的方法来进行种子生产，但是这一过程生产的种子需要严格把控，所以种子不纯主要还是由于母本去雄不彻底自交而产生的假杂种，所以一般纯度鉴定只需要找到在F1代与母本之间有多态性的引物即可。但是还有另外几个原因会导致种子不纯：一是亲本纯度不够或者混有其他自交系;二是杂交种收获时人为或机械的混杂;三是隔离不好，传入其他品种的花粉。因此，笔者将进一步对种子纯度鉴定构建多重PCR体系，保证品种的真实性，提高准确率。

在大量的试验研究中，SSR标记广泛应用于品种特异性（DUS）测试和亲本DNA指纹图谱的构建，并在许多作物中已经成功应用。例如赖运平等[18]利用SSR分子标记对26份自交系和54份3个年度DUS测试品种为研究材料，最后的聚类分析结果与品种系谱基本吻合，说明SSR标记可用于DUS测试中甘蓝型油菜近似品种的筛选。李超汉等[15]通过分析比较5个西瓜新品种的亲本材料SSR引物的多态性表现，构建了9份亲本材料的DNA指纹图谱。DNA指纹图谱在未来作为解决品种鉴定困境的新技术，将成为品种DUS测试的核心，具有重要的应用前景。

笔者利用SSR分子标记法，以西瓜甜瓜的3个批次为材料，运用西瓜甜瓜种子DNA快速提取方法，筛选出了能够区分杂交种且与父母本具有互补带型的SSR引物，并利用特异性引物对西瓜‘W1806、甜瓜‘M1805进行的纯度鉴定结果与田间鉴定结果的吻合率都在98%以上。充分说明了SSR分子标记技术对西瓜和甜瓜纯度鉴定结果都是可靠的，并为SSR分子标记技术在西瓜甜瓜纯度鉴定中的应用打下坚实的基础。笔者将利用这一技术，结合田间育种，进一步深入探究西瓜抗枯萎病基因及构建甜瓜单性花性状的快速鉴定体系。

参考文献

[1]  LUAN F，DELANNAY I，STAUB J E.Chinese melon Cucumis[J].Euphytica，2008，164（2）：445-461.

[2]  李干琼，王志丹.我国西瓜产业发展现状及趋势分析[J].中国瓜菜，2019，32（12）：79-83.

[3]  SENSOY S，BUYUKALACA S，ABAK K.Evaluation of genetic diversity in Turkish melons （Cucumis melo L.） based on phenotypic characters and RAPD markers[J].Genetic Resources and Crop Evolution，2007，54（6）：1351-1365.

[4]  LI G，QUIROS C F.Sequence-related amplified polymorphism （SRAP），a new marker system based on a simple PCR reaction：its application to mapping and gene tagging in Brassica[J].Theoretical and Applied Genetics，2001，103（2/3）：455-461.

[5]  MONFORTE A J，GARCIA-MAS J，ARUS P，et al.Genetic variability in melon based on microsatellite variation[J].Plant Breeding，2003，122（2）：153-157.

[6]  韩宏伟，王浩，佘建华，等.利用SRAP标记快速检测西瓜杂交种子纯度[J].新疆农业科学，2017，54（9）：1621-1626.

[7]  SHARMA V，SHARMA T R，RANA J C，et al.Analysis of genetic diversity and population structure in Horsegram （Macrotyloma uniflorum）using RAPD and ISSR markers[J].Agricultural Research，2015，4（3）：221-230.

[8]  刘富中，刘万勃，宋明，等.利用RAPD快速鉴定甜瓜杂交种的遗传纯度[J].中国蔬菜，2002（5）：7-9.

[9]  GUO S G，ZHANG J G，SUN H H，et a1.The draft genome of watermelon （Citrullus lanatus） and resequencing of 20 diverse accessions[J].Nature Genetics，2012，45（1）：51-58.

[10] 孙波，邹甜，王志伟，等.利用SSR技术鉴定西瓜品种纯度[J].中国瓜菜，2018，31（6）：16-19.

[11] NAITO Y，SUZUKI S，IWATA Y，et al.Genetic diversity and relationship analysis of peanut germplasm using SSR markers[J].Breeding Science，2008，58（3）：293-300.

[12] YILDIZ M，EKBIC E，KELES D，et al.Use of ISSR，SRAP and RAPD markers to assess genetic diversity in Turkish melons[J].Scientia Horticulturae （Amsterdam），2011，130（1）：349-353.

[13] POWELL W，MACHRAY G C，PROVAN J.Polymorphism revealed by simple sequence repeats[J].Trends in Plant Science，1996，1（7）：215-222.

[14] 許勇，欧阳新星，张海英，等.西瓜黄瓜快速简单RAPD技术的研究[C]//中国科协第3届青年学术年会园艺学卫星会议暨中国园艺学会第2届青年学术讨论论文集，南京：东南大学出版社，1998：481-486.

[15] 李超汉，刘莉，刘翔，等.基于SSR标记的5个西瓜新品种纯度鉴定及特异性分析的研究[J].中国农学通报，2015，31（33）：177-185.

[16] 宋海斌，崔喜波，马鸿艳，等.基于SSR标记的甜瓜品种（系）DNA指纹图谱库的构建[J].中国农业科学，2012，45（13）：2676-2689.

[17] 王慧，张从合，陈金节，等.一种快速检验杂交西瓜种子荃抗绿霸纯度的方法：安徽，CN-104480208 A[P].2015-04-01.

[18] 赖运平，张浙峰，王丽容，等.利用SSR标记筛选DUS测试中甘蓝型油菜近似品种[J].分子植物育种，2013，11（2）：174-184.