果香风味导向白地霉M5的分离鉴定及生物学特性研究

贾丽艳 田宇敏 荆 旭 郭晋田 王晓勇 王庆亮 韩 英

（1 山西农业大学食品科学与工程学院 山西太谷030801 2 山西省白酒生物工程研究生教育创新中心 山西太谷030801 3 山西杏花村汾酒厂股份有限公司 山西汾阳032209）

风味导向技术是采用现代风味化学及分析化学理论，从白酒的微量成分中发现和确定对白酒具有风味贡献度的风味化合物。通过风味化合物的指向，形成功能微生物筛选技术、风味化合物发酵调控技术、风味优化重组技术，可促进中国白酒酿造理论、品质及技术升级[1]。

中国白酒是世界六大蒸馏酒之一，由于地理环境、原料及工艺的不同，中国不同地域的白酒具有不同的风格。白酒由98%～99%的酒精和水及1%～2%的风味物质构成[2]。白酒风格的不同主要是由风味物质组成及含量的不同所致。清香型白酒是中国白酒主要的一支，而汾酒又是清香型白酒的典范，其采用传统酿造技艺，以高粱、豌豆、大麦为原料，通过网络区域环境中独特的微生物，采用固态地缸发酵，清蒸二次清工艺，甑桶蒸馏而成，其独特的风味物质组成赋予了汾酒清香醇正的风格[3]。徐岩等[1]利用GC-O 技术，从汾酒中共检测到香气组分100 个，包括辛酸乙酯、β-DMST、己酸乙酯、乙缩醛、乙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、3-苯丙酸乙酯、乙酸-3-甲基丁酯、β-苯乙醇等酸类、醛类、醇类、酯类、酚类、吡嗪类、呋喃类、萜烯类等物质。汾酒酒醅是一个天然优质的微生物菌种资源库。依据风味导向技术，从酒醅中分离筛选产风味物质菌株，对于中国白酒的纯种发酵、强化发酵或定向发酵生产具有重要的意义。

本研究利用国家级白酒品酒师的嗅闻技术和HS-SPME-GC-MS 检测技术，从汾酒酒醅中分离筛选产果香风味酵母。通过菌落及菌体形态观察、生理生化特征及26S rDNA 基因序列系统发育分析技术鉴定产香菌株，研究其生物学特性，为该菌株在中国白酒及其它酿造类食品中的应用奠定基础，为清香型白酒的纯种发酵或强化发酵提供优质菌种资源。

1 材料与方法

1.1 样品

山西杏花村某酒厂新鲜发酵酒醅。

1.2 培养基

选择培养基：孟加拉红选择培养基，购自北京路桥公司。

YEPD 培养基：葡萄糖2 g，蛋白胨2 g，酵母提取物1 g，蒸馏水100 mL，pH 5.0～5.5、121 ℃，0.1 MPa 灭菌20 min[4]。

麦芽汁培养基：将8 g 麦芽汁浸提膏溶解于100 mL 水中，121 ℃，0.1 MPa 灭菌20 min。

发酵用培养基：包括液态发酵用培养基（YEPD 培养基）和4 种固态发酵用培养基，分别为（1）麸皮和高粱组合培养基：15 g 麸皮、15 g 粉碎高粱和30 mL 水；（2）稻壳与高粱组合培养基：15 g 粉碎高粱、7.5 g 稻壳和12.5 mL 水；（3）高粱培养基：15 g 粉碎高粱和15 mL 水；（4）糖化酶与高粱组合培养基：15 g 红糁、0.06 g 糖化酶和12 mL 水。以上培养基混匀后，121 ℃，0.1 MPa 灭菌20 min。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌的分离 取新鲜酒醅10 g，放入无菌生理盐水中，混匀，28 ℃，静置30 min，10 倍倍比稀释至10-5。分别取100 μL 倍比稀释液涂布于孟加拉红选择培养基上，静置20 min 后，28 ℃倒置培养48 h，选择酵母菌菌落特征明显的单菌落，进一步划线2～3 次，获得纯菌落。将纯化的疑似酵母菌落转入YEPD 固体斜面，4 ℃保存，备用。

1.3.2 酵母的筛选 将酵母菌株接种于YEPD 和麦芽汁培养基中，28 ℃恒温培养3 d。3 名国家级白酒品酒师对发酵液进行闻香，并记录闻香结果。

1.3.3 香气物质的测定 将10%产香酵母接种于发酵用培养基中，28 ℃摇床培养24 h，以未接菌的培养基原料作为对照，通过嗅觉闻香及HSSPME-GC-MS 技术检测不同培养基对菌株产香能力的影响。

1.3.4 HS-SPME-GC-MS 条件 GC 条件：TG-5MS 色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），柱温采用程序升温，起始温度50 ℃，保留时间2 min，以5℃/min 升至240 ℃，保留5 min；进样口温度为240℃，载气为He 流速1.0 mL/min，氦气流速：1 mL/min；柱前压57.4 kPa，分流比10∶1。MS 条件：电离方式EI，电离电压70 eV，离子源温度230 ℃，连接杆温度230 ℃，扫描范围：33～450 amu。数据检索：通过计算机对检出的各组分进行检索，以Willey和NIST 为检索谱库[5-7]。

1.3.5 产酯能力的测定 以10%的接种量将活化好的菌株分别接种于发酵用培养基中，28 ℃培养24 h，每隔2 d 测定发酵培养基的总酯含量[8]。

1.3.6 菌株的鉴定

1.3.6.1 菌株形态学观察及理化特性分析 参照文献[9-12]做菌落、菌体形态观察与生理生化分析。

1.3.6.2 菌株26S rDNA 的PCR 扩增及序列的测定和系统发育分析 酵母菌 26S rDNA D1D2区域序列扩增引物为 NL1 （5'-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3'）和NL4（5'-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3'），购自上海生工公司。序列的测定由上海生工完成。登陆http//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank，对待测菌株26s r DNA 序列进行BLAST 比对；选取数据库中有代表性的菌株26S rDNA，采用clustalx 1.83 软件的Multiple Sequence Alignment 程序进行同源性序列比对；采用MEGA5.1 软件，以邻接法（Neighbour-joining）构建系统发育树（Bootstrap=1 000）[13]。

1.3.7 产香菌生长曲线的测定 将活化的菌株接种于麦芽汁培养基中，28 ℃培养24 h 后，以3.0%的接种量转入灭菌的麦芽汁液体培养基中，28 ℃，160 r/min 培养，每隔3 h 取样，测定OD600值。以未接种麦芽汁培养基作空白对照，重复试验3 次，求其平均值，绘制生长曲线[14]。

1.3.8 酸碱耐受性的测定 用1 mol/L HCl 溶液分别调节YEPD 培养液pH 为2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，灭菌后，以3.0%的接种量接入菌株M5，28 ℃、160 r/min 振荡培养24 h 后，测定OD600值，考察其耐酸碱能力。试验重复3 次，以未接种YEPD 培养基为空白对照。

1.3.9 糖耐受性的测定 将对数生长期的菌株分别以3.0%的接种量接种于含有50，100，150，200，250，300，350，400 g/L葡萄糖质量浓度的YEPD液体培养基中，28 ℃、160 r/min 培养24 h，测定OD600值。试验重复3 次，以未接种YEPD 培养基为空白对照。

1.3.10 酒精耐受性的测定 将对数生长期的菌株分别以3%的接种量接种于含有体积分数分别为3%，6%，9%，12%，15%，18%，21%酒精的YEPD液体培养基中，28 ℃，160 r/min 培养24 h，测定OD600值。试验重复3 次，以未接种YEPD 培养基为空白对照。

1.3.11 温度耐受性的测定 将对数生长期的菌株分别以3.0%的接种量接种于YEPD 液体培养基中，分别置于28，30，35，40，45，50 ℃培养24 h，测定OD600nm值。试验重复3 次，以未接种YEPD 培养基为空白对照。

1.3.12 总酯含量的测定 采用碱皂化法，按GB/T19777-2013 规定的方法测定。

2 结果与分析

2.1 产香菌的初筛

经富集培养，平板涂布，划线分离和对风味物质的嗅闻，从清香型白酒酒醅样品中分离、筛选菌株，获得1 株产清新果香味的菌株M5。

2.2 菌株M5 发酵香气感官评价

微生物的风味代谢产物的种类不仅与菌体有关，而且也受发酵用原料的影响[15]。为此，将菌株M5 接种于4 组不同的固体培养基和1 组YEPD液体培养基中，分别编号为空白对照，1，2，3，4，5。置于28 ℃培养24 h 后，国家级品酒师对发酵后的培养基进行闻香试验。结果见表1。闻香评价结果表明添加糖化酶高粱培养基的产香效果最好，第4 组的原料产香效果最好；YEPD 液体培养发酵液香气次之。

表1 闻香试验结果Table 1 Results of smelling test

2.3 产香菌香气成分测定结果

以未发酵培养基为对照，采用HS-SPMEGC-MS 联用法测定香气佳的组4 和组5 挥发性香气成分，色谱图见图1，通过峰面积归一化法计算出各样品中风味物质的相对含量，并根据风味物质的类别分类，结果成分分析见表2。

菌株的生长、代谢受环境条件的影响较大。不同培养基、不同培养条件可能会影响产香菌株产生香气成分的不同。对菌株M5 在YEPE 培养基和糖化酶与高粱组合发酵培养基及未发酵培养基里的主体风味物质的测定，共检测出香气成分151种，其中醇类22 种，酯类47 种，酸类17 种，醛类12 种，酮类8 种，酚类8 种，烷烃类23 种，烯烃类2 种，杂环类11 种，表4为主要香气成分分析结果。

未经发酵的糖化酶与高粱组合培养基本身香气成分共分离出70 种化学成分，经鉴定得59 种化合物，分别为：醇类18 种，占总挥发性香气成分的48.2%；酯类4 种（0.44%）；酸类7 种（12.29%）；酚类6 种（34.16%）；醛类、酮类、烷烃类、烯烃类和杂环类共22 种，占总挥发性香气成分的4.33%。固态培养基原有香气成分主要是醇类和酚类，以（2R，3R）-（-）-2，3-丁二醇和4-乙基愈创木酚为主，4-乙基愈创木酚具有木香和香荚兰的隐香。

图1 菌株M5 发酵产生的挥发性香气成分GC-MS 总离子流色谱图Fig.1 The total ion chromatogram on volatile aroma components of M5 in different fermented broth by GC-MS

菌株M5 发酵糖化酶与高粱组合培养基中挥发性成分经检测，鉴定出67 种化合物，其中醇类7 种，占总体挥发性香气成分的35.43%；酯类36种，占总体挥发性香气成分的51.32%；酸类、醛类、酮类、酚类、烷烃类和杂环类共25 种，总计香气挥发成分含量为12.4%。与对照相比，β-苯乙醇和异戊醇等高级醇是其主要的挥发性香气成分，也是酒精发酵所得副产物，这些化合物是由酵母在相应的氨基酸分解代谢下形成，或由葡萄糖代谢途径形成[16]。β-苯乙醇香气具有清甜玫瑰花香、茉莉和紫罗兰香气，占总挥发性成分的28.14%；异戊醇具有苦杏仁不愉快气味。酯类物质增加了33 种，可见固态发酵对脂类香气成分及含量具有较大的影响，其中乙酸乙酯具有水果香味；癸酸乙酯具有椰子香、梨果香和酒香香气；己酸乙酯具有水果香气味；丁酸乙酯具有强烈的甜果香，有菠萝、香蕉、苹果气息；丙酸乙酯具有菠萝香气味；辛酸乙酯具有菠萝、苹果样的香韵和白兰地的酒香味。烯萜类和杂环类物质的含量较低，但对增加物质风味的丰富性起重要作用，2-乙基-6-甲基吡嗪具有坚果、焙烤和甜香香气。多酚类化合物是重要的抗氧化类化合物，在添加产香菌M5 后检测到对乙烯基愈创木酚，具有强烈香辛料、丁香香气，2，6-二叔丁基对甲酚和愈创木酚的香气强度虽不大，但与对照相比明显增多。

YEPD 培养基中检测鉴定出45 种化合物，其中酯类10 种（11.57%）；醇类3 种（6.87%）；酸类3种（9.65%）；醛类9 种（37.86%）；酮类、酚类、烷烃类、烯烃类和杂环类共19 种，占总挥发性成分含量的17.48%。香气成分主要为癸酸乙酯具有椰子香、梨果香气；丁酸具有刺激性及难闻的气味，与低级醇生成的酯类具有水果的香味；苯甲醛具有苦杏仁味；苯乙醛具有浓郁的玉簪花香气。菌株M5 发酵YEPD 培养液中检测鉴定出55 种化合物，包括：醇类6 种，占总体挥发性香气成分的45.18%；酯类21 种（14.02%）；酸类5 种（26.4%）；醛类、酚类、烷烃类和杂环类共22 种，总计香气挥发成分含量为11.61%。与YEPD 原液比较，醇类物质增加了5 种，其中β-苯乙醇具有清甜玫瑰花香、茉莉花香和紫罗兰香气；异丁醇具有杂醇油的醇香味；异戊醇具有苦杏仁的味道。酯类增加了11 种：丙酸乙酯、乙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯具有强烈苹果和菠萝味；异丁酸乙酯具有特殊芳香味；肉豆蔻酸乙酯具有极温和鸢尾香气。相同的酯香成分只有一种为邻苯二甲酸二丁酯，表明菌株M5生成的挥发性香气成分主要为酯类和醇类。

比较菌株M5 发酵固、液培养基中挥发性成分，发现发酵固态培养基中酯类化合物的种类较多，香气浓郁。产玫瑰香β-苯乙醇的相对含量增加最为明显，是代表性的香气产物；酯类化合物的种类和相对含量也明显提高。发酵YEPD 培养液中脂肪酸的香气强度比较明显，有浓郁的酸味，其中丁酸和2-甲基丁酸具有难闻的脚臭、汗臭味，这可能是引起后期液态发酵香气不够轻盈、纯净的原因。杂环类物质的含量较低，但可能对增加物质风味的丰富性起重要作用[17]。

表2 菌株M5 产生主体香气成分分析Table 2 Analysis of aroma components in fermentation broth of strain M5

（续表2）

2.4 菌株M5 的产酯能力

随发酵时间的延长，菌株M5 的产酯能力呈先升高后降低的趋势（图2）。菌株在发酵第6 天时液态和固态培养基产酯能力达到最高，为24.8g/L 和26.5 g/L（以乙酸乙酯计）。蒲春等[8]从大曲中筛选到产酯高的异常毕赤酵母，该酵母麸曲产酯能力可达到0.19 g/L。甘广东等[22]从浓香型酒醅中分离到两株优势酵母菌分别为陆生地霉（Geotrichum terrestre）和季也蒙毕赤氏酵母（Pichia guilliermondii），其产酯能力达到1.5，2.4 g/L。与之相比较，菌株M5 产酯能力高出10 倍多，具有较强的产酯能力。

2.5 菌株M5 的鉴定

图2 菌株M5 的产酯能力Fig.2 Producing ester ability of strain M5

2.5.1 菌株M5 的菌落、菌体形态及液体培养特性 图3a 和图3b 为菌株M5 接种于YEPD 和麦芽汁固体培养基上的菌落形态。菌株M5 菌落呈奶油色或乳白色，中间有圆形凸起，表面不光滑，质地油，不干燥；周围褶皱，短绒毛状，地毯式向四周铺开。在YEPD 培养基上菌落呈同心环，在麦芽汁培养基上呈放射状向四周延伸。产香菌M5 菌体呈砖形，节孢子单生呈长筒状或椭圆形（图3c），可连接成链状。繁殖方式以裂殖为主，无出芽细胞，大小为4.27～10.25 μm×2.78～5.62 μm。有横隔真菌丝（图3d），以二叉分枝的形式出现，无假菌丝产生，不产生子囊孢子。图3为产香菌M5 的液体培养基。接种培养48 h 后，发酵液澄清，液体表面有乳白色菌膜，成环沿试管壁向上生长，不易碎（图3e）。

图3 菌株M5 的菌落、菌体形态及液体培养特征Fig.3 Micrographic，colony and of strain M5 and cultural characteristics in the liquid medium

2.5.2 菌株M5 的生理生化鉴定 参照巴尼特[11]的《酵母菌的特征与鉴定手册》对菌株M5 进行了生理生化试验，结果见表3。

2.5.3 分子生物学鉴定 以菌株M5 的总DNA为模板，NL1 和NL4 为引物，扩增菌株M5 的26S rDNA 近5'端的D1/D2 序列并测序。将序列登陆http：//www.genbank.com 进行BLAST 比对，比对结果见表4。由表4可知，菌株M5 与地霉属白地霉具有很高的序列相似性，达到99%。以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株为外群，使用MEGA5.1 软件，通过多序列比对，以邻接法构建进化树，结果表明菌株M5 与地霉属白地霉（G.candidum）的亲缘关系最近（图4）。

综合菌株M5 的菌落、菌体特征、培养特征及系统发育分析结果，将其确定为白地霉（G.candidum），命名为白地霉M5。

表3 菌株M5 的生理生化特性Table3 The physiological and biochemistry characteristics of strain M5

表4 菌株M5 测序结果比对Table 4 The results on sequence alignment of strain M5

图4 菌株M5 的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of strain M5

2.6 菌株M5 的生长与产酯量的关系

图5 菌株M5 的生长与产酯量的关系Fig.5 The relation on growth of strain M5 and ester quantity producting by strain M5

由图5可知，培养时间为0～18 h，OD600值增长缓慢，表明菌株M5 生长处于延滞期，此时总酯含量增长也较缓慢，发酵液释放淡淡的果香；发酵时间为18～69 h 时，OD600值指数级增长，表明菌株处于对数生长期，总酯含量增长较快；此时发酵液释放令人愉快的果香、花香和巧克力味香气；发酵时间在69 h 以后，OD600值逐渐降低，表明菌株M5开始进入衰亡期，此时酯含量还在增长，但是发酵液释放的香气较复杂，有臭鸡蛋的味道。以上结果表明，菌体的产酯能力随着发酵时间的延长而增长，令人愉悦的香味物质主要产生于对数生长期；不良的气味可能是由于菌株的衰亡而引起的。

2.7 菌株M5 的耐受性

2.7.1 酸碱耐受性 由图6可知，当pH 2 时，OD600值几乎为零，表明该菌株具有较强的耐酸性能，最低酸耐受pH 为3；随着pH 的增大，OD600值先增大后降低，表明菌株生物量呈先上升后下降的趋势，菌株生长最适pH 为4；当pH 达到7 以上时，OD600值几乎为零，表明菌株完全不再生长，菌株最高耐受pH 值为6。该菌株具有较低的碱耐受性。

2.7.2 糖耐受性 由图7可知，随着糖度的升高，OD600值先升高后降低，表明菌株生物量先升高，后降低，当糖度为10%时，菌株生长最旺盛，后随着糖浓度的增加而降低，菌株生长的速率变缓；当糖度达到40%时，菌株不再生长，由此可见，菌株M5 最高耐受糖度为35%，最适生长糖度为10%。

图6 菌株M5 耐酸碱性Fig.6 Acidity and alkaline tolerance of strain M5

图7 菌株M5 耐糖性Fig.7 Glucose tolerance of strain M5

2.7.3 酒精耐受性 由图8可知，随着酒精度的升高，OD600值逐渐降低，表明随着酒精体积分数的不断增加，菌株M5 生长逐渐受到影响，菌株适合在酒精度低的条件下生长繁殖。当酒精度达到21%时，OD600值趋于零，表明菌株的生长完全受到抑制，菌株M5 最高耐酒精度为18%。

2.7.4 温度耐受性 由图9可知，随着培养温度的升高，OD600值逐渐降低，当温度达到45 ℃时，OD600值趋于零，表明菌株M5 在25 ℃的条件下生长较旺盛，随着温度的不断升高，菌株的生长受到抑制，生长速率变缓，当温度达到45 ℃时，菌株完全不生长。菌株最高耐受温度为40 ℃。

3 结论

图8 菌株M5 耐酒精性Fig.8 Ethanol tolerance of strain M5

图9 菌株M5 耐温度性Fig.9 Temperature tolerance of strain M5

通过嗅闻技术和HS-SPME-GC-MS 检测技术，从清香型白酒的新鲜酒醅中分离、筛选获得一株能够产生愉悦水果香气的菌株M5，该菌株在糖化酶和高粱组合固体培养基上发酵，产生果香味，清香味，并夹杂奶香味，香气最佳，主要的香气物质为酯类和醇类，其中产玫瑰花香的B-苯乙醇占到了香气物质的28.14%，产酯能力高达26.5g/L。通过形态学，生理生化试验和26S rDNA 序列分子生物学鉴定及系统发育分析，确定该菌株属于地霉属的白地霉 （G.candidum），命名为白地霉M5。菌株M5 对环境具有一定的耐受性，可以在pH 3～6、酒精度0%～18%、糖度5%～35%、温度25～40 ℃条件下生长代谢，最适生长糖度为10%，pH 4。本研究将为清香型白酒及风味导向的中国白酒发酵调控提供理论基础及优质菌种资源。