益气活血软坚解毒方对肝癌H-22细胞增殖的影响*

张旼旼 黄新宇 戴 慧

杭州市肿瘤医院 浙江 杭州 310002

晚期肝癌患者常伴有体力、免疫功能、营养状况低下等状况[1]，往往不能耐受放疗、化疗等积极治疗措施。寻求能够抑制肿瘤生长，抑制肝癌细胞增殖，且患者更易耐受的治疗方法成为治疗所需。益气活血软坚解毒方（YHRJ）是由生黄芪、炒白术、藤梨根、白花蛇舌草、田三七、半枝莲、水红花子等中药组成的复方制剂，前期研究中已发现，该方剂在肝癌的治疗中有增效减毒的作用。本文中，我们将探讨YHRJ在抑制肝癌细胞生长和增殖作用中的分子作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物与瘤株：动物：BALB/c小鼠，购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司，动物许可证号SCXK（沪）2013-0016。饲养条件：恒温22±2℃，湿度50%～60%，光照每12小时明暗交替，换风次数15～20次/小时。由浙江中医药大学动物实验研究中心饲养，实验饲养室许可证号SYXK（浙）2013-0184。瘤株：H-22肝癌细胞瘤株，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.2 药物与试剂：药物：益气活血软坚解毒方（YHRJ）组成：生黄芪、藤梨根、白花蛇舌草、半枝莲各30g，炒白术15g，田三七、水红花子各8g，凌霄花9g，炮山甲10g。常规水提取，配成等效剂量YHRJ 3.4g/ml、高剂量YHRJ 6.8g/ml，4℃保存备用。奥沙利铂(OXA)：江苏恒瑞医药股份有限公司产品，用5%葡萄糖液调配成1g/L的溶液，遮光保存。试剂：苏木素染液为servicebio产品，伊红染液购于珠海贝索生物技术有限公司，增殖细胞核抗原（PCNA）抗体为Affinity产品，免疫组化试剂盒产自MDL，逆转录试剂盒、PCR试剂盒均为康为世纪公司产品。

1.3 动物模型制备：取48只小鼠，收集对数生长期H-22肝癌细胞，调整细胞浓度为1×107个/ml，于颈部右侧皮下接种0.2ml，继续饲养2周，待肿瘤增殖至可以触及时，将动物随机分为6组：A组：对照（NS）组；B组：OXA组（1.5mg/kg）；C组：等效剂量YHRJ组（3.4g/ml生药，0.3ml）；D组：等效剂量YHRJ+OXA组（B+C联合给药）；E组：高剂量YHRJ组（6.8g/ml生药，0.3ml）；F组：高剂量YHRJ+OXA组（B+E联合给药）。对照组及YHRJ单药组采用灌胃的给药方法，每天分别给于0.9%NaCl及YHRJ（等效剂量浓度为3.4g/ml生药，高剂量浓度为6.8g/ml生药）各0.3ml，1次／d，连续14d；OXA组采用腹腔注射OXA（剂量为1.5mg/kg，用5%葡萄糖液调配成0.5ml/鼠，1次/d）连续14d；联合组每天灌胃给予YHRJ 0.3ml及腹腔注射OXA 0.5ml，1次/d，连续14d。

1.4 实验方法：分述如下。

1.4.1 YHRJ对H-22肝癌细胞小鼠皮下移植瘤生长的影响：每隔3天观察肿瘤的生长情况，测量肿瘤长径(L)和横径(W)，单位为毫米(mm)。2周后处死小鼠，肿瘤体积=(L×W2)/2；肿瘤抑瘤率=[(A-B)/A]×100%。A为模型组对照组的肿瘤体积，B为给药实验组的肿瘤体积。

1.4.2 HE染色观察肝癌组织细胞的形态变化：取肿瘤组织放入10%中性甲醛固定，取材包埋切片。经常规脱蜡、脱水，苏木素染色，盐酸乙醇分化，伊红液染色后脱水、透明、中性树胶封片。400倍显微镜下观察、拍照。

1.4.3 免疫组化检测肝癌组织中细胞增殖核抗原（PCNA）的蛋白的表达：将肝组织石蜡切片脱蜡、脱水，进行抗原热修复，消除内源性过氧化物酶活性，按照免疫组化试剂盒说明进行免疫杂交后，DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、中性树胶封片。切片在200倍显微镜下随机选取不重复6个视野（其中棕色部分即为蛋白表达区域，蓝色为细胞核。图片采用Image pro plus软件分析，计算棕色蛋白表达面积和累计光密度）。

1.4.4 RT-PCR检测小鼠肿瘤组织中PCNA、转录因子NF-KB、细胞周期蛋白Cyclin D1的mRNA的表达：将肿瘤组织用Trizol法提取总RNA，根据逆转录试剂盒操作说明进行逆转录反应，逆转录反应条件：42℃，15min；85℃，5min。按照PCR试剂盒说明进行PCR反应，反应条件：95℃，10min变性；95℃，15s；60℃，60s；40次循环。RT-PCR所用引物序列信息见表1。

表1 引物序列信息

1.5 统计学方法：数据分析采用SPSS 19.0统计软件，所有数据以均值±标准差（±s）表示，作图采用Graph-Pad Prism 8软件。两组间比较采用两个独立样本的t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 YHRJ对H-22肝癌细胞小鼠皮下移植瘤生长的影响：与NS组相比，各给药组肿瘤体积均有所缩小，其中，除等效剂量YHRJ组外，其他各组中肿瘤体积均缩小显著（P＜0.05或P＜0.01）；两联合组抑瘤率均达35%以上，且均大于OXA组，其中，高剂量YHRJ+OXA组较OXA组有统计学差异（P＜0.01），表明YHRJ可抑制肝癌细胞的生长，浓度越高，抑瘤效果越显著。详见表2。

表2 各组小鼠肿瘤终体积及抑瘤率（±s）

表2 各组小鼠肿瘤终体积及抑瘤率（±s）

注：与A组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与B组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

images/BZ_26_1310_656_2302_727.png—30.03 7.09 38.25 24.29 50.26 A组B组C组D组E组F组8 8 8 8 8 8 465.4±118.1 325.7±65.3*432.4±102.4▲287.4±93.7**352.4±94.3*231.5± 68.2**▲▲

2.2 HE染色观察肝癌组织细胞的形态变化：从图1可知，NS组肿瘤细胞生长活跃，细胞密集，细胞呈现多边形或不规则形，细胞核较大，核仁清晰、核膜完整、核分裂相明显。给药后，等效剂量YHRJ组、高效剂量YHRJ组中肿瘤细胞有一定程度坏死轻微，核深染的肿瘤细胞数量以及核分裂象有一定程度减少。等效剂量YHRJ+OXA组、高剂量YHRJ组、高剂量YHRJ+OXA组相较于NS组疗效明显，可见肿瘤组织中出现肿瘤细胞坏死现象。肿瘤细胞发生坏死程度从高到低依次为：等效剂量YHRJ+OXA组、高剂量YHRJ+OXA组、OXA组、高剂量YHRJ组、等效剂量YHRJ组。

图1 HE染色观察YHRJ对小鼠肝癌增殖的影响（HE染色，400倍）

2.3 免疫组化观察检测PCNA的表达：各组小鼠肿瘤组织中均有PCNA表达，与NS组相比，各给药组中PCNA表达均有一定程度下降，表明YHRJ可下调PCNA的表达，其中高剂量组效果更显著（P＜0.05）。等效剂量YHRJ+OXA组、高剂量YHRJ+OXA组中PCNA的表达较OXA组也有显著性下降（P＜0.05）。见表3。

表3 YHRJ方对小鼠肝癌中PCNA表达的影响（±s）

表3 YHRJ方对小鼠肝癌中PCNA表达的影响（±s）

注：与A组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与B组比较，▲P＜0.05。

images/BZ_27_177_385_1160_443.png4210.7±560.2 2835.0±573.9**3767.9± 681.7▲1859.8±631.8**▲3086.4±1097.6*2067.0±557.1**▲A组B组C组D组E组F组6 6 6 6 6 6 29987.8±3957.0 20351.2±3967.1**26828.7±4832.3▲13360.7±4649.3**▲22247.5±7419.7*14864.5±4015.3**▲

2.4 实时定量PCR：与NS组比较，各给药组肿瘤组织中PCNA、NF-KB及Cyclin D1的mRNA水平均显著性下调（P＜0.05或P＜0.01）。与OXA组比较，等效剂量YHRJ联合+OXA组、高剂量YHRJ+OXA组肿瘤组织中PCNA、NF-KB及Cyclin D1的mRNA水平均下调，但未见显著性差异（P＞0.05）。见表4。

表4 肿瘤组织中PCNA、NF-KB及Cyclin D1的mRNA水平（±s）

表4 肿瘤组织中PCNA、NF-KB及Cyclin D1的mRNA水平（±s）

注：与A组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

images/BZ_27_173_1460_1173_1518.pngA组B组C组D组E组F组1.00±0.09 0.72±0.07*0.79±0.07*0.68±0.08**0.75±0.11*0.60±0.07**3 3 3 3 3 3 1.00±0.09 0.68±0.11*0.77±0.11*0.61±0.08**0.74±0.08*0.58±0.10**1.00±0.09 0.7±0.12*0.80±0.08*0.66±0.06**0.72±0.10*0.61±0.08**

3 讨论

细胞周期紊乱是肿瘤最主要的发生机制，细胞周期中各类分子、蛋白的异常表达都可能引起肿瘤的发生[2]。本研究通过测量小鼠肝癌H-22细胞移植瘤大小，证实YHRJ可以抑制肿瘤的生长，HE染色结果也表明，YHRJ可以诱导肿瘤细胞发生坏死，抑制细胞增殖。为探讨其可能作用机制，作者检测了细胞周期中参与细胞生长、增殖等过程的相关蛋白、基因的表达情况。

增殖细胞核抗原(PCNA)是一种分子量为36KD的酸性蛋白，为DNA聚合酶δ的辅助因子，PCNA在G1晚期表达增加，S期达到高峰，其量的变化与DNA合成一致，是评价细胞增殖状态的一个指标。在肿瘤细胞中，PCNA呈现过表达状态[3]。本研究通过免疫组化检测组织细胞中PCNA蛋白、PCR法检测细胞中PCNA mRNA水平发现，YHRJ可下调PCNA蛋白和mRNA的表达，提示YHRJ可能通过抑制组织细胞中PCNA蛋白的合成、PCNA mRNA的表达来发挥抑制细胞增殖的作用。

NF-KB是细胞内重要的核转录因子，其在癌症增殖，侵袭和转移中起重要作用，且与较差的预后相关[4]。细胞周期蛋白D1也在许多恶性肿瘤的细胞生长中起关键作用[5-6]。有文献报道，NF-κB可通过磷酸化p65和IκB等分子，上调其下游分子Cyclin D1，促使细胞发生分裂与增殖。Cyclin D1蛋白的过表达会使细胞增殖不断进行，导致肿瘤的发生[7]。本研究中的结果也论证上述观点，YHRJ可抑制NF-KB/Cyclin D1信号传导来抑制肝癌H-22细胞增殖，抑制肿瘤的生长。

综上所述，YHRJ能够显著抑制肝癌H-22细胞移植瘤的生长，对肝癌H-22的增殖具有抑制作用，其发挥抑制作用的机制可能是通过下调PCNA的表达、抑制NFKB/Cyclin D1信号传导来实现的。这一结果，将为YHRJ在肝癌的治疗研究中提供更为有力的证据。