中草药复配乳蛋白ACE抑制肽的试验研究

(安徽农业大学茶与食品科技学院,安徽合肥 230036)

高血压作为常见的心血管疾病之一,它具有患病率高、易引起并发症等特点,是导致中风、冠心病的罪魁祸首,是人类健康隐形的杀手[1-2]。血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)[3]是作为一种独特的用于治疗该类疾病的药物,得到了广泛的关注和研究。因此,开发新的ACEI是降压药物的研究热点。

随着人们对于治疗药物安全性、有效性和适用性要求的逐步提高,研究人员转而从人们日常生活可接触到的、同时具有食用和药用价值的中草药、营养类成分等着手,来研究更高疗效、更好耐受性的ACEI药物。乳和乳制品是人类最好的食源蛋白质,不仅含有丰富的营养物质,还富含具有重要的生理功能生物活性肽类,其中,多种具有ACEI活性的乳蛋白多肽被发现[4]。中药材是中华文明的宝贵资源库,几千年的经验积累,筛选出大量具有ACEI效应的药食同源药材,这些材料具有安全性高、副作用小等显着特点,有效开发利用意义重大[5]。目前,关于乳制品和中草药配伍的研究不是很多,因此,研究这样一款辅助降压功效的牛奶具有重要的现实意义。

本试验以脱脂乳和药食同源中草药为材料,以ACE为靶标,研究确定脱脂乳酶解处理的最佳工艺参数,筛选出具有较高ACEI活性的药食同源中草药。在此基础上,研究脱脂乳酶解液和中草药浸提物的最佳配比,完成一款具有辅助降压功效的功能性牛奶的实验室研究,为商业开发利用提供理论依据和技术参数。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

脱脂奶粉 新西兰恒天然出品;胰蛋白酶(酶活力为≥2500.0 U/mg);ACE(0.1U/mL) 美国Sigma公司;马尿酰-组氨酰-亮氨酸(N-hippuryl-his-leu,HHL) 美国Sigma公司;马尿酸标准品 北京索莱宝科技有限公司;其他试剂 均为国产分析纯;15味试验药材(山楂、决明子、枸杞、桔梗、白芍、黄芪、银杏叶、栀子、牡丹皮、玉竹、人参、佛手、桑叶、菊花、山药) 合肥为民大药房。

PE-Lambda紫外分光光度计 珀金埃尔默股份有限公司;高速冷冻离心机 北京时代北利离心机有限公司;STARTER2100 pH计 美国奥斯豪仪器有限公司;FLUKO弗鲁克高剪切分散机 上海弗鲁克流体机械制造有限公司;CX-100型粉碎机 上海市晟喜制药机械有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 脱脂乳酶解工艺 将脱脂乳配制成具有一定底物浓度的溶液,调整温度和pH至胰蛋白酶的最适反应条件,加入胰蛋白酶,采用pH-stat法[6]使pH控制在pH±0.05之间,结束反应后,沸水浴灭酶10 min并迅速冷却,用1 mol/L HCl调pH至7.0,8000 r/min冷冻(4 ℃)离心30 min,上清液冷冻干燥后备用[6]。

1.2.2 酶解优化的单因素实验

1.2.2.1 底物质量浓度对ACE抑制活性的影响 底物质量浓度分别为3、4、5、6、7、8 g/100 mL,加酶量4%(酶与底物质量分数比)、pH7.0、温度40 ℃酶解3 h,测定ACE抑制率。

1.2.2.2 加酶量对ACE抑制活性的影响 加酶量分别为1%、2%、3%、4%、5%,底物浓度为6 g/100 mL、pH7.0、40 ℃条件下反应3 h,测定ACE抑制率。

1.2.2.3 pH对ACE抑制活性的影响 pH分别为5、6、7、8、9,底物质量浓度为6 g/mL、加酶量4%、温度40 ℃酶解3 h,测定ACE抑制率。

1.2.2.4 酶解时间对ACE抑制活性的影响 酶解时间分别为2、4、6、8、10 h,底物质量浓度为6 g/mL、加酶量4%、pH7.0、酶解温度40 ℃,测定ACE抑制率。

1.2.2.5 酶解温度对ACE抑制活性的影响 酶解温度分别为15、25、35、45、55 ℃,底物质量浓度为6 g/mL、加酶量4%、pH7.0、酶解3 h,测定ACE抑制率。

1.2.3 响应面试验设计 利用单因素试验的水平范围,根据Box-Benhnken中心组合试验设计原理[7],以ACE抑制率为响应值,设计四因素三水平的响应面试验(参见表1)。

表1 Box-Behnken试验设计因素与水平表Table 1 Factors and levels table of Box-Behnken test design

1.2.4 ACE抑制率的测定 根据Nakamura等[8-9]方式测定ACE抑制率,所需药品以及具体步骤见表2。

表2 ACE抑制活性体外检测方法(μL)Table 2 In vitro determination of ACE inhibitory activity(μL)

按照表2将试剂按顺序加到试管中混匀,于37 ℃水浴中反应1h后加入1 mol/L HCl溶液100 μL终止反应;然后取1.2 mL乙酸乙酯于各试管旋涡萃取后进行离心(4000 r/min,10 min);然后吸取750 μL乙酸乙酯层移于已标号的试管中,在沸水浴中挥发完全后加入去离子水3 mL,充分溶解在228 nm下测定其吸光值,计算公式如下:

式中:Ab:加入缓冲液的样品光密度值;Aa:加入抑制剂的样品光密度值;Ac:反应前样品灭酶的光密度值。

1.2.5 中草药的筛选 结合中医对高血压病症的治疗以及目前中药治疗高血压的研究资料[10],选择山楂、决明子、枸杞等15味中草药进行ACE抑制活性筛选试验研究。

1.2.5.1 单一中草药提取液的制备及ACE抑制活性测定 15种中药材粉碎,过100目筛后浸提处理。采用超声波辅助浸提法,去离子水为提取液,液料比为15∶1,50 ℃超声辅助浸提60 min,过滤,得中药提取液[11]。用pH=8.3的硼酸缓冲液配成浓度为20.0 mg/mL的溶液,采用紫外分光光度计法检测提取液的ACE抑制活性,设3次重复[8-9]。

1.2.5.2 混合中草药提取液的制备 按1.2.5.1方法制备中草药提取液,将两种ACE抑制活性较高的中草药按4∶0、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、0∶4比例进行混合得混合中草药提取液。用pH=8.3的硼酸缓冲液配成浓度为20.0 mg/mL的溶液,采用紫外分光光度计法检测提取液的ACE抑制活性,设3次重复[9-10]。

1.2.6 酶解液和中草药提取液的配比研究 将酶解液和已确定的最佳中草药按4∶0、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、0∶4比例进行混合,测定ACE抑制活性,确定最佳配比。

1.3 数据处理

采用Design Expert 7.0.0软件对响应面结果进行分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 底物质量浓度对酶解液ACE抑制率的影响 由图1可知,ACE抑制率随着底物(脱脂乳)质量浓度的增加,先升高,后降低,在6 g/100 mL时达到最大58.08%。反应液中底物的浓度小,与酶结合的量就小,反应效率低,抑制作用不明显;但是增加底物量到达临界值后全部的酶都被结合,抑制作用达到最大,之后抑制率开始下降。

图1 底物质量浓度对ACE抑制率的影响Fig.1 Effect of substrate concentration on ACE inhibitory activity

2.1.2 加酶量对酶解液ACE抑制率的影响 由图2可知,ACE抑制率随着加酶量的增加,先升高,后降低。当加酶量为4%,ACE抑制率最高,最大为56.44%,加酶量继续增加,ACE抑制率下降。分析原因可能是,当反应液中酶含量低,浓度小时,与其结合的底物也相应较少,催化分解作用慢;但当酶的浓度增大后,相应结合更多的底物,出现过度酶解的现象,从而降低对 ACE的抑制性[12]。此外,实际生产中一般加入较低浓度的酶,节约成本。

图2 加酶量对ACE抑制率的影响Fig.2 Effect of enzyme addition on ACE inhibitory activity

2.1.3 pH对酶解液ACE抑制率的影响 由图3可知,ACE抑制率随着pH的增加,先升高,后降低。当pH=7时,ACE抑制率最高为56.86%,分析原因可能是,当pH过大或过小时,都会破坏蛋白质的结构,影响酶催化反应的发生。

图3 pH对ACE抑制率的影响Fig.3 Effect of hydrolysis pH on ACE inhibitory activity

2.1.4 酶解时间对酶解液ACE抑制率的影响 由图4可知,2～6 h内,增加反应时间,抑制作用也持续增大,但从6～10 h却有所下降。酶催化反应发生6 h后,抑制活性下降可能是由于ACE抑制肽同样是由氨基酸按不同序列排列成的肽类成分,在酶的催化作用下,降解成其他的肽类片段或者游离性氨基酸,而失去抑制活性。据文献Mullally等[13]报道发现,ACE对底物的抑制作用也与酶催化时间有关,随着反应时间延长,酶被分解,造成了抑制活性的降低。此结论与文献报道一致。最终确定最适酶解时间为6 h。

图4 酶解时间对ACE抑制率的影响Fig.4 Effect of hydrolysis time on ACE inhibitory activity

图5 酶解温度对ACE抑制率的影响Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on ACE inhibitory activity

表3 Box-Behnken试验结果Table 3 Box-Behnken experimental results

表4 响应面试验方差分析表Table 4 Analysis of variance table of the response surface methodology

注:***差异极显著(P<0.001);**差异高度显著(P<0.01);*差异显著(P<0. 05)。2.1.5 酶解温度对酶解液中ACE抑制率的影响 由图5可知,ACE抑制率随着温度的升高,先增大,后减小。酶解温度的升高加速酶解反应的进程,在35 ℃左右达到最大值;当温度高于35 ℃时,蛋白酶的活性降低导致反应减缓,ACE抑制率有所降低。因此选择35 ℃为响应面温度因素的中心值。

2.4 响应面优化胰蛋白酶酶解脱脂乳工艺参数

2.4.1 响应面试验结果 胰蛋白酶酶解脱脂乳获得高ACE抑制率的活性肽的工艺参数响应面试验优化结果参见表3。通过Design Expert 7.0.0软件对表3数据进行分析,结果见表4。

根据表4分析得到回归方程:ACE抑制率(%)=54.87+0.81A+1.68B+1.53C+4.63D-3.02AC+1.51AD-2.23BC-2.43BD+3.61CD-4.18A2-3.5B2-1.89C2-4.12D2。

从表4分析可得出ACE抑制率回归方程中的总回归项是极显著的(P<0.001),这表明ACE抑制率方程拟合度较好,试验的可信度和准确度很高;而失拟项不显著则说明试验的误差小。

结果表明:实验因素和响应值的之间不是一次线性关系,各因素之间有较强的交互作用。通过模型优化得出酶解脱脂乳的最优条件为:底物质量浓度7 g/100 mL、加酶量 5%、酶解温度30.74 ℃、pH6.92,此条件下ACE抑制率为59.29%。

2.4.2 酶解工艺条件的验证实验 为检验响应面法所得结果的准确性,采用上述优化条件进行降血压肽的制备,考虑到实际操作的方便,将参数修正为底物质量浓度7 g/100 mL、加酶量5%、酶解温度为31 ℃、pH为6.9,ACE抑制率为58.51%,相对误差在1.31%左右。因此,响应面法对优化酶解条件参数具有指导意义。

2.5 最佳中草药的选择

2.5.1 单一中草药的ACE抑制活性 不同中草药对酶解液ACE抑制率之间的影响如图6所示。

图6 不同中药的影响Fig.6 Effect of different Chinese medicine

由图6可知,不同中药的ACE抑制活性是有差异的,活性大小排序为:山楂>决明子>枸杞>桔梗>白芍>黄芪>银杏叶>栀子>牡丹皮>玉竹>人参>佛手>桑叶>菊花>山药;山楂和决明子的ACE抑制活性最高,分别为50.88%、45.34%。

山楂的主要成分是黄酮类成分,其对血压的影响机制是通过扩张冠状血脉,舒张血管,产生降压作用[14]。陈佩瑶等[15]研究了决明子蛋白质、低聚糖和蒽醌苷等,均有明显的降压作用,结果具有统计学意义,与利血平组降压作用相当。给药结束后10 d,决明子低聚糖给药组的大鼠血压明显降低,决明子蒽醌苷降压作用更明显,而复方利血平和决明子蛋白质的降压作用不明显。

2.5.2 混合中草药的ACE抑制活性 山楂提取液和决明子提取液不同配比对ACE抑制活性的影响见图7。

图7 山楂和决明子的配比对ACE抑制率的影响Fig.7 Effect of proportion of hawthorn and semen cassiae on ACE inhibitory activity

由图7可知,山楂提取液和决明子提取液配比不同时,ACE抑制活性也不同[16],当山楂提取液和决明子提取液为2∶1时,ACE抑制率较高为52.52%。

2.6 酶解液和中草药提取液的配比研究

酶解液和中草药提取液(山楂∶决明子为2∶1)的配比对ACE抑制率的影响见图8。

图8 酶解液和中药提取液的配比对ACE抑制率的影响Fig.8 Effect of proportion of enzymatic hydrolysate and extraction solution of Chinese traditional medicine on ACE inhibitory activity

由图8可知,当酶解液和中药提取液配比不同时,ACE抑制活性也不同,当酶解液:中药提取液为1∶1时,ACE抑制率较高为59.09%。复方中药配伍酶解液对ACE抑制活性具有明显影响,其可能是通过多种靶点,多种途径共同实现[17]。酶解液配合中草药复方可以为寻找安全的降压药物提供参考,但两者配伍用药的共同作用机制,有待进一步研究。

3 结论

本实验研究的胰蛋白酶酶解脱脂乳的最佳工艺参数为:底物质量浓度7 g/100 mL、酶解时间6 h、加酶量 5%、酶解温度31 ℃、pH6.9,所得酶解产物的ACE抑制率最高,为58.51%。同时,以ACE抑制率为指标,从15味药食同源的中草药中筛选出ACE抑制活性较高的山楂和决明子两位中草药。

实验表明,山楂和决明子提取液复配时ACE抑制活性较高,且山楂和决明子提取液按2∶1复配时,ACE抑制活性较高,为52.52%。脱脂乳胰蛋白酶酶解液和山楂与决明子中药提取液按1∶1复配时,ACE抑制率可达59.09%,ACE抑制活性稍有改善。

将具有调节血压效应的药食同源中草药配伍牛奶蛋白酶解液,对设计一款具有辅助调节血压效应的保健功能性乳制品提供参考价值,对研究食疗保健和乳制品的功能性具有理论和实践探讨意义。