nC22矿物油及其与吡虫啉混用对柑橘木虱的室内毒力评价

高 晶, 杨琼玉, 冯耀恒, 毛润乾

(广东省生物资源应用研究所, 广东省动物保护与资源利用重点实验室, 广东省野生动物保护和利用公共实验室,广东省矿物油农药工程技术研究中心, 广州 510260)

柑橘木虱Diaphorinacitri是一种重要的柑橘害虫，可传播柑橘黄龙病(huanglongbing, HLB)病菌，柑橘黄龙病是柑橘生产最严重的病害，号称“柑橘癌症”，目前尚无有效药剂进行治理，因而控制媒介昆虫柑橘木虱是防控柑橘黄龙病的主要措施(Iftikharetal., 2014)。目前，化学药剂防治仍是控制柑橘木虱的主要手段，但化学药剂长期、大量使用，不仅增加害虫抗药性、造成防治成本高，还会危及有益生物、污染环境，因此需要新型防治策略(刘斌, 2015)。

矿物油属于有机农药，具有对环境友好、不产生抗药性且无残留、对有益生物毒害小等优点，是理想的害虫综合治理药剂(张志恒和陈丽萍, 2005)。目前矿物油被用于多种害虫的防治，如柑橘红蜘蛛Panonychuscitri(Chenetal., 2009)和柑橘小实蝇Dacusdorsalis(欧阳革成等, 2010)等，矿物油也被用于对柑橘木虱的防治，研究集中在在田间或大棚内向寄主喷洒矿物油并调查柑橘木虱种群，以评价矿物油对柑橘木虱的防治效果(Raeetal., 1997; Tanseyetal., 2015)，缺乏矿物油对柑橘木虱的室内毒力数据。矿物油不仅可直接作为杀虫剂，还可作为化学杀虫剂的增效剂，研究表明在适当配比混配时矿物油对化学杀虫剂具有增效作用，两者混配使用可更有效防控蚜虫、螨类等害虫，并可减少化学杀虫剂使用量(Taverneretal., 2011; Wrightetal., 2017)。目前评价矿物油与化学杀虫剂联合使用效果的方法，多是在田间或室内用药剂喷洒植物，随后调查害虫存活数目，以死亡率的大小判断农用矿物油与化学杀虫剂联合使用是否有防治效果和增效作用，且矿物油与化学杀虫剂混配对柑橘木虱的防治效果目前尚无报道。

nC22矿物油(茂名22号)为中石化股份有限公司茂名分公司和广东省生物资源应用研究所合作，首次研发出的符合国家农药用精炼矿物油基础油标准的农用矿物油(梁智永等, 2019)，研究其对柑橘木虱的毒力将为使用国产矿物油基础油进行害虫防控提供支持。本研究以nC22矿物油及柑橘木虱为研究对象，以nC23矿物油(绿颖, 有报道为nC24, 本课题组测得相对正构烷烃平均碳数23, 未发表数据)和nC28矿物油(150SN)为阳性对照，去离子水为阴性对照，实验室内采用浸渍法和喷雾法，探究矿物油单剂对不同发育阶段柑橘木虱的毒力；将nC22矿物油和吡虫啉混配，探究不同混配比例对柑橘木虱若虫的毒力，并用交互测定法、共毒因子法和共毒系数法筛选具有增效作用的混配比例。本研究探究矿物油及与吡虫啉混用对柑橘木虱的毒力，为在田间防治柑橘木虱提供科学依据，试验结果可进一步在田间进行验证。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1供试昆虫及植物：柑橘木虱采自中山大学南校区的九里香Murrayapaniculata;寄主植物九里香购自广州岭南花卉市场。柑橘木虱及植物饲养在温室内，设置为温度26±1℃，相对湿度70%±5%，光照强度6 000 lx，光周期14L∶10D。

1.1.2供试试剂及药品：所用矿物油nC22基础油来自中国石化茂名分公司和广东省生物资源应用研究所，浓度为828.8 kg/m3；阳性对照nC23为99%乳油制剂来自韩国SK株式会社，浓度为834.2 kg/m3；nC28基础油来自中国石化茂名分公司，浓度为867.3 kg/m3；阴性对照为去离子水；吡虫啉杀虫剂为70%水分散粒剂，来自拜耳作物科学有限公司。矿物油乳化剂为广东省生物资源应用研究所研发的乳化剂(一种农用喷洒油的乳化剂，CN200510101977.3)。

1.2 矿物油单剂对柑橘木虱的室内毒力测定

1.2.1不同浓度矿物油农药配制：将乳化剂按5%添加量分别加入至nC22和nC28矿物油基础油中，配制成95% nC22矿物油乳剂和95% nC28矿物油乳剂(以下简称矿物油)，与购买的99% nC23矿物油乳剂共3种，在预试的基础上用去离子水稀释5个浓度。

1.2.2矿物油对柑橘木虱卵的致死作用：将20株带有嫩梢的九里香放于温室，接入100头柑橘木虱成虫，3 d后移去成虫，剪取带有卵的嫩梢，用Nikon体视显微镜(SMZ1000)观察并记录卵的个数。参照浸渍法(李玲玲等, 2009)对卵进行室内毒力测定。将带卵的嫩梢分别浸泡在10 mL不同浓度的矿物油和去离子水中，20 s后取出，用湿润的棉花包住嫩梢的叶柄，放置在垫有湿润滤纸的培养皿中，转移至培养箱，设置与温室内同样的培养条件，每天记录卵的孵化情况直至第7天不再有卵孵化，统计未孵化卵的个数，计算死亡率。nC22矿物油分别稀释12.5, 25, 50.0, 100和200倍， nC23矿物油分别稀释3.12, 6.25, 12.5, 25和50倍，nC28矿物油分别稀释6.25, 12.5, 25, 50和100倍，以去离子水为对照，每个处理3次重复。

1.2.3矿物油对柑橘木虱若虫的致死作用: 用Zeiss体视显微镜(Discovery 20)观察各龄期柑橘木虱的形态特征(Tsai and Liu, 2000)，将其分为低龄若虫(1-3龄)和高龄若虫(4-5龄)(吴丰年等, 2015)。

采用喷雾法，参考Xue等(2009)的方法进行室内毒力测定。向培养皿(直径7 cm，高1 cm)的底部倒入10 mL 1.5%琼脂，放九里香嫩叶片于琼脂表面，将15头柑橘木虱低龄若虫移至培养皿，使用喷雾塔(10 psi/50 kpa)分别喷洒5 mL不同浓度的矿物油及去离子水至培养皿中，然后转移至培养箱，打开培养皿盖干燥30 min，盖上盖子，24 h后，记录低龄若虫的死亡数，计算死亡率。nC22矿物油分别稀释1 200, 2 000, 2 800, 3 600和4 000倍，nC23矿物油分别稀释1 200, 2 000, 2 800, 3 600和4 000倍，nC28矿物油分别稀释200, 400, 800, 1 200和1 600倍，以去离子水为对照，每个处理3次重复。高龄若虫做同样处理，分别喷洒不同浓度矿物油及去离子水, nC22矿物油分别稀释200, 400, 600, 800和1 000倍，nC23矿物油分别稀释200, 400, 600, 800和1 000倍，nC28矿物油分别稀释12.5, 25, 50, 100和200倍。

1.2.4矿物油对柑橘木虱成虫的致死作用:采用1.2.3节描述的喷雾法进行测定，将15头柑橘木虱成虫移至培养皿后，使用喷雾塔分别喷洒不同浓度矿物油及去离子水至培养皿，然后转移至培养箱，干燥30 min，再放置24 h后，记录成虫的死亡数，计算死亡率。nC22矿物油分别稀释50, 100, 200, 400和800倍，nC23矿物油分别稀释12.5, 25, 50, 100和200倍，nC28矿物油分别稀释25, 50, 100, 200和400倍，以去离子水为对照，每个处理3次重复。

1.3 矿物油与吡虫啉混配对柑橘木虱的毒力测定

将nC22矿物油和吡虫啉单剂分别配制为LC50值所对应浓度的溶液，用该浓度溶液按不同体积比进行混配，混配比例分别为：矿物油∶吡虫啉=0∶10, 1∶9, 2∶8, 3∶7, 4∶6, 5∶5, 6∶4, 7∶3, 8∶2, 9∶1和10∶0；组别命名为1-11，以去离子水为对照，检测对低龄若虫的毒力作用，方法同1.2.3节，每个处理3次重复。采用3种方法检测分析。

(1)交互测定法：按公式计算实际死亡率和理论死亡率，根据理论死亡率绘制等效线，若实际死亡率在等效线上方，表示该配比混剂具有增效作用，反之则为拮抗作用，若实际死亡率接近等效线，表明该配比混剂具有相加作用(汪涛, 2017)。

实际死亡率(%)=(处理组死亡率-对照组死亡率)/(100-对照组死亡率)×100;

理论死亡率(%)=A药剂LC50剂量下试虫实际死亡率×混剂中A药剂LC50所占的比例+B药剂LC50剂量下试虫实际死亡率×混剂中B药剂LC50所占的比例。

(2)共毒因子法：按公式计算共毒因子(co-toxicity factor, CTF)。如共毒因子大于20表示为增效作用，小于-20表示为拮抗作用，在-20～20之间表示为相加作用(陈雪林等, 2011)。

共毒因子=(实际死亡率-理论死亡率)/理论死亡率×100。

(3)共毒系数法：上述两种方法筛选得到的有增效作用的矿物油与吡虫啉配比液，即矿物油∶吡虫啉=3∶7, 4∶6, 7∶3，将3种混配液用去离子水分别稀释为不同的浓度，3∶7配比液稀释浓度为80.22, 40.11, 26.74, 20.05, 16.04和13.37 mg/L；4∶6配比液稀释浓度为105.93, 52.96, 35.31, 26.48, 21.19和17.65 mg/L；7∶3配比液稀释浓度为183.07, 91.54, 61.03, 45.77, 36.61和30.51 mg/L。矿物油单剂(10∶0, v/v)用去离子水稀释浓度为688.98, 415.01, 344.49, 298.88和234.06 mg/L，吡虫啉单剂(0∶10, v/v)用去离子水稀释浓度为25.00, 12.50, 6.25, 3.13, 1.56, 0.78和0.39 mg/L。

按照1.2.3节方法测定对柑橘木虱低龄若虫的毒力作用，得到3种混配剂、矿物油单剂和吡虫啉单剂的LC50值，计算共毒系数(co-toxicity coefficient, CTC)，如共毒系数大于120表示增效作用，80-120之间表示相加作用，小于80表示拮抗作用(汪涛, 2017)。

毒力指数(TI)=标准药剂的LC50/供试药剂的LC50×100;

混剂实际毒力指数(ATI)=标准药剂的LC50/混剂的LC50×100;

混剂理论毒力指数(TTI)=TI(A)×药剂A在混剂中的质量分数+TI (B) ×药剂B在混剂中的质量分数;

共毒系数(CTC)=混剂实际毒力指数(ATI)/混剂理论毒力指数(TTI)×100。

1.4 数据分析

用SPSS V21.0统计软件进行Probit回归分析，计算毒力回归方程的斜率及斜率标准误，LC50值和95%置信区间。

2 结果

2.1 矿物油单剂对柑橘木虱的毒力

与nC23和nC28 2种矿物油相比，nC22矿物油对柑橘木虱卵的毒力最高，处理后7 d其LC50值最低，为7 164.068 mg/L，其次为nC28矿物油，LC50值为24 576.238 mg/L。对柑橘木虱卵毒力最低的为nC23矿物油，LC50值为94 604.142 mg/L(表1)。对照去离子水对卵的致死率为(2.19±1.33)%。

3种矿物油中，nC22矿物油对低龄若虫的毒力略高于nC23矿物油，处理后1 d其LC50分别为253.620和299.187 mg/L，nC28矿物油对低龄若虫的毒力最低，LC50值为2 050.802 mg/L(表2)。对照去离子水对低龄若虫没有致死作用。

nC22矿物油对高龄若虫的毒力略高于nC23矿物油，处理后1 d其LC50值分别为1 327.410和1 750.929 mg/L，最低的为nC28矿物油，LC50值为22 344.371 mg/L(表3)。对照去离子水对高龄若虫没有致死作用。

nC22矿物油对成虫的毒力较略高于nC28矿物油，处理后1 d其LC50值分别为5 939.204和7 100.003 mg/L，最低的为nC23矿物油，LC50值为37 861.712 mg/L(表4)。对照去离子水对成虫没有致死作用。

表1 矿物油对柑橘木虱卵的毒力Table 1 Toxicity of mineral oils to eggs of Diaphorina citri

表2 矿物油对柑橘木虱低龄若虫的毒力Table 2 Toxicity of mineral oils to the early instar nymphs of Diaphorina citri

表3 矿物油对柑橘木虱高龄若虫的毒力Table 3 Toxicity of mineral oils to the late instar nymphs of Diaphorina citri

表4 矿物油对柑橘木虱成虫的毒力Table 4 Toxicity of mineral oils to adults of Diaphorina citri

2.2 矿物油吡虫啉混配对柑橘木虱若虫的毒力

交互测定法分析不同配比的混配剂对柑橘木虱低龄若虫的毒力(处理后1 d)结果见图1。nC22矿物油与吡虫啉配比为5∶5, 6∶4和8∶2时，柑橘木虱的实际死亡率接近等效线，表明两者具有相加作用；混配比例为1∶9, 2∶8和9∶1时，柑橘木虱的实际死亡率在等效线下方，表明两者具有拮抗作用；配比为3∶7, 4∶6和7∶3时实际死亡率位于等效线的上方，表明这3个配比混剂具有增效作用；对这3个点向等效线做垂线，垂线段越长，增效作用越大，即增效作用从大到小依次为7∶3, 3∶7和4∶6。

图1 柑橘木虱低龄若虫上nC22矿物油对吡虫啉的增效作用(交互测定法)Fig. 1 Synergistic effect of nC22 mineral oil on imidacloprid on the early instar nymphs of Diaphorina citri by interactive determination method

共毒因子法分析不同配比的混配剂对柑橘木虱低龄若虫的毒力(处理后1 d)结果见表5。nC22矿物油与吡虫啉混配比例为5∶5, 6∶4和8∶2时，共毒因子在-20～20之间，表明两者具有相加作用；混配比例为1∶9, 2∶8和9∶1时，共毒因子均小于-20，表明两者具有拮抗作用；混配比例为3∶7, 4∶6和 7∶3时共毒因子都大于20，表明按这3种配比进行混配使用时，nC22矿物油对吡虫啉具有增效作用，其中，配比为7∶3时共毒因子最大，结果与交互测定法一致。

共毒系数法测定nC22矿物油与吡虫啉混配对柑橘木虱低龄若虫的毒力(处理后1 d)结果见表6。当nC22矿物油与吡虫啉混配比例为7∶3, 4∶6和3∶7时，共毒系数均大于120，表明3个混配比例都有增效作用，且7∶3比例混配时共毒系数最大，与前面两种分析方法结果一致。

表5 柑橘木虱低龄若虫上nC22矿物油对吡虫啉的增效作用(共毒因子法)Table 5 Synergistic effect of nC22 mineral oil on imidacloprid on the early instar nymphs of Diaphorina citri by co-toxicity factor (CTF) method

表6 柑橘木虱低龄若虫上nC22矿物油对吡虫啉的增效作用(共毒系数法)Table 6 Synergistic effect of nC22 mineral oil on imidacloprid on the early instar nymphs of Diaphorina citri by co-toxicity coefficient (CTC) method

3 讨论

矿物油在21世纪初就被纳入害虫综合治理(IPM)药剂，可防治多种害虫。田间试验发现喷洒矿物油可控制柑橘木虱密度并减少黄龙病发生(Leongetal., 2012)，但矿物油对柑橘木虱的室内毒力缺乏研究，且矿物油与化学杀虫剂混配对柑橘木虱的毒力尚未见报道。本研究室内测定nC22矿物油单独使用以及与吡虫啉混配对柑橘木虱的毒力，比较nC22矿物油与进口nC23矿物油、传统nC28矿物油对各发育阶段柑橘木虱的毒力，并利用交互测定法、共毒因子法和共毒系数法评价nC22矿物油对吡虫啉防治柑橘木虱的增效作用，结果表明：单独使用时，其毒力高于nC23矿物油及nC28矿物油；与吡虫啉联合使用时，nC22矿物油与吡虫啉混配比例为3∶7, 4∶6和7∶3时对吡虫啉具有增效作用，且理论上7∶3混配比例对吡虫啉具有最大的增效减量作用。本研究为利用矿物油为杀虫剂和增效剂来防治柑橘木虱的进一步开发应用提供理论依。

矿物油对昆虫的毒力因龄期而异，本研究发现nC22矿物油对柑橘木虱低龄若虫毒力最高，对卵的毒力最低(表1～4)，与田间试验结果一致(Raeetal., 1997)。矿物油被广泛认为是通过在昆虫表面形成完整的油膜，使昆虫窒息而死，宜于防治体型较小昆虫，因而对低龄若虫毒力最高(张志恒和陈丽萍, 2005)，本研究中nC23和nC28矿物油也是对柑橘木虱低龄若虫毒力最高(表2)。矿物油对卵的毒力大小因害虫种类而异，Xue等(2009)比较矿物油对不同发育阶段二斑叶螨Tetranychusurticae和智利小植绥螨Phytoseiuluspersimilis的LC50，发现矿物油对二斑叶螨卵毒力最高，而对智利小植绥螨卵的毒力最低，推测与卵的表面结构、大小、孵化时间等因素有关，如二斑叶螨卵表面附有丝，可吸附矿物油，导致对矿物油敏感，因此，可能柑橘木虱卵的一些生理特性导致矿物油对其毒力低。此外，成虫各方面发育完全、头部和翅为革质，且移动性强，因而矿物油对其毒力低(Xueetal., 2009)。本研究对不同龄期柑橘木虱的毒力结果表明，当柑橘木虱低龄若虫较多时，适宜喷洒nC22矿物油进行防控。

矿物油理化性质影响其作用效果及安全性，这些理化性质包括相对正构烷烃平均碳数(nCy)、相对正构烷烃碳数差、非磺化物含量、粘度、密度等，然而具体影响因素及机理却不清楚。已报道nCy和相对正构烷烃碳数差影响矿物油的拒避效果(欧阳革成等, 2007)，粘度比重影响矿物油抑制昆虫传毒效果(Wijs, 1980)。我们检测出3种矿物油在这些理化性质方面存在差异(未发表数据)，表明矿物油对昆虫的毒力也可能与其理化性质有关。检测发现3种矿物油中nC22和nC23矿物油符合农业部精炼矿物油标准，nC22比nC23毒力高，可能也与相对正构烷烃碳数差差异有关：nC22和nC23的nCy分别为22和23，相对正构烷烃碳数差分别为2和5，因矿物油中的碳数含量一般呈正态分布，相对正构烷烃碳数差越小，nCy所占的百分比含量越高，毒力越高。虽然矿物油对害虫毒力机理及有效组分需进一步探索，本研究证明我国研发的矿物油基础油对柑橘木虱毒力略高于进口矿物油，可助于推动农用矿物油使用的国产化。

矿物油可增加化学杀虫剂的渗透性、粘着性、展着性、扩散性和持效性，增加有效成分的沉积量和抗冲刷能力，并协助有效成分渗透进入害虫和作物体内，从而有效提高化学杀虫剂的防治效果(全金成等, 2018)。本研究通过交互测定法、共毒因子法初步筛选，再用共毒系数法验证及定量，最终确定矿物油与吡虫啉以7∶3的混配比例混配后对柑橘木虱低龄若虫的毒力最高。根据单剂中吡虫啉的有效浓度和混配剂中吡虫啉的有效浓计算，达到95%死亡率时，nC22矿物油与吡虫啉以7∶3的混配比例使用理论上可减少吡虫啉用量达91.95%。因吡虫啉属于内吸式杀虫剂，矿物油可能通过促进吡虫啉在植物叶片和柑橘木虱体表的渗透性和展着性，以达到增效目的。吡虫啉被报道可用于柑橘木虱的防控(Chen and Stelinski, 2017)，但吡虫啉可对非靶标生物, 如天敌、鱼类、蜜蜂等产生致命性，并且随着吡虫啉的滥用，靶标害虫产生抗性的速度增大(邱光, 2005)，本研究结果对顺应绿色农业和无公害农业的发展趋势，减少吡虫啉用量具有重要指导意义。此外，矿物油具有广谱性，对作物及果树上小型昆虫，如蚜虫、螨、红蜘蛛、柑橘小实蝇等均具有毒杀作用(欧阳革成等, 2007; Xueetal., 2009; Galimberti and Alyokhin, 2018; 全金成等, 2018)，因此矿物油与化学杀虫剂混用，还可以同时控制多种害虫，从而进一步减少化学杀虫剂的使用。矿物油单独使用以及与吡虫啉联合使用对柑橘木虱的毒力还需要后续进行田间试验，以验证nC22矿物油在柑橘木虱防治中的应用。