紫杉醇靶向Hippo信号通路抑制食管鳞癌干细胞干性的机制研究

宿伟鹏 张 洋 张宋安 刘 攀 赵化荣

食管癌(esophageal carcinoma, EC)病死率位居恶性肿瘤第6位，是世界第八大常见恶性肿瘤之一，其5年生存率仅为15%～25%[1]。主要表型分为食管腺癌(esophageal adenocarcinoma, EAC)及食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)，其中ESCC多发于中国及亚太其他地区，年发生率超过40万例，占总发生率的90%[2]。目前常用治疗手段有内镜下切除治疗、外科手术、放射治疗(以下简称放疗)及化学治疗(以下简称化疗)等，其中化疗方案中常用紫杉醇(paclitaxel, PTX)配合治疗方案。紫杉醇是由红豆杉树皮中分离提纯的具有良好抗肿瘤效果的天然次生代谢产物，是继阿霉素和顺铂后最有效的广谱抗癌药物，可作用于微管，抑制细胞有丝分裂，破坏细胞周期，被广泛应用于治疗食管癌、头颈癌、乳腺癌、肺癌等诸多恶性肿瘤[3～5]。另一方面，近年来肿瘤干细胞学的新兴提示肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSCs)可能是肿瘤化疗抵抗的根本原因，而紫杉醇对食管癌肿瘤干细胞的作用及机制未见阐明[6,7]。因此，本研究旨在通过分离食管鳞癌干细胞(ESCC-CSCs)，通过紫杉醇诱导，进一步探究紫杉醇对ESCC-CSCs细胞干性的作用及其作用机制。

材料与方法

1.材料:人食管癌细胞TE-13细胞系(ATCC)；PBS、胰蛋白酶、胎牛血清和1640培养基(美国Hyclone公司)；Hoechst33342、碘化丙啶(propidium iodide, PI)染液、维拉帕米(中国碧云天公司)；CD44、SOX2免疫荧光抗体(CST)；紫杉醇(2mg/ml，大连美仑生物公司)；CCK-8试剂盒(美国AbMole公司)；B27(美国Invitrogen公司)；人重组表皮因子、碱性成纤维上皮生长因子、肝素(美国Sigma-Aldrich公司)；胰岛素(400U/支，江苏万邦生化医药股份有限公司)；TRIzol、反转录试剂盒及荧光定量PCR试剂盒(天根生化科技有限公司)；RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、蛋白Marker(中国碧云天公司)；p-TAZ、TAZ、CD44、SOX2多克隆抗体、IgG(美国Santa cruz公司)；PCR检测引物由金斯瑞生物科技有限公司设计合成，引物序列见表1。

表1 引物序列

2.ESCC-CSCs细胞的分离、培养与鉴定:(1)ESCC-CSCs细胞的分离及培养:以人食管鳞癌细胞系TE-13细胞常规培养于含10%胎牛血清的1640培养基中，置于37℃、5%CO2恒温培养箱中，培养2～3代后取对数生长期细胞2×106个/毫升单细胞悬液，分别加入6μg/ml Hoechst33342、100mmol/L维拉帕米，室温孵育90min，染色结束后迅速转移细胞至4℃冰上终止染色。离心沉淀细胞，FACS缓冲液重悬细胞至1×107个/毫升，加入2μg/ml PI后过400目滤网上流式细胞仪参照侧群细胞(side population cells, SP细胞)的分离分选方法，测量前向散射和侧向散射参数[8]。以Hoechst red为X轴，Hoechst blue为Y轴做二维散点图，取低Hoechst red/blue及维拉帕米缺失的区域为目标SP细胞，即ESCC-CSCs，收集分选出的SP细胞常规培养传代，进行后续实验。(2)ESCC-CSCs细胞鉴定:取2～4代ESCC-CSCs细胞消化重悬后均匀滴加在共聚焦专用皿底部中央，待细胞贴壁生长至50%密度后弃培养基，冰PBS洗涤细胞2次，分别避光加入CD44抗体(FITC标记)和SOX2抗体(藻红蛋白标记)与Hoechst33342共染色30min，弃染液，4%多聚甲醛固定细胞后上机观察并采集照片。(3)分组及处理:实验分为两组：空白对照组(NC)及实验组(PTX)，空白对照组ESCC-CSCs细胞不做任何处理，实验组细胞依据实验需要加入终浓度为1.25μg/ml的紫杉醇处理，收集处理后的各组细胞进行后续实验。

3.CCK-8:收集处于对数生长期的ESCC-CSCs细胞，消化离心后重悬至5×104个/毫升接种至96孔板中，每孔接种100μl，实验组细胞培养基中含1.25μg/ml的紫杉醇，常规培养0、24、48、72h后，每孔加入10μl CCK-8溶液，37℃培养箱中孵化4h，上酶标仪检测各孔细胞在450nm处的吸光度(A)值。每组5个副孔，取平均值。

4.克隆形成实验:ESCC-CSCs细胞经紫杉醇处理诱导48h后，消化收集2组细胞，重悬调整细胞密度至1×103个/孔，充分吹打至单个细胞后将细胞悬液接种至预热的含10ml 1640培养基的100mm培养皿中，轻轻摇动分散细胞，于37℃、5% CO2恒温培养箱中静置培养3周。弃培养基，用冰PBS润洗培养皿3次，加入4ml 4%多聚甲醛固定液固定细胞克隆，移除固定液，加入适量1%结晶紫染色液避光染色30min，染色结束后用冰PBS反复缓慢冲洗培养皿至PBS不再变色，弃去PBS，室温晾干后观察并记录克隆形成数目。

5.干细胞成球实验:1640完全培养基中加入B27(1∶50)、20ng/ml人重组表皮因子、20ng/ml碱性成纤维上皮生长因子、40g/ml肝素及50g/ml胰岛素配置成干细胞培养基。ESCC-CSCs细胞经紫杉醇处理诱导48h后，消化收集两组细胞，以5×103个/孔密度接种于低黏附6孔板内，加入干细胞培养基常规培养，培养10天后，显微镜下观察并采集图像，记录每孔中直径>75μm的细胞球个数(a)，计算细胞球形成效率(sphere formation efficiency, SFE)，SFE(%)=(a/接种细胞总数)×100%。

6.Western blot法检测相关蛋白表达:将各组处理后的单层生长的细胞用冰PBS缓慢冲洗2次，加入含1%PMSF的RIPA裂解液1ml至覆盖全部培养板，置于冰上孵育30min，用细胞刮将帖壁细胞刮下转移至1.5ml EP管中，4℃12000r/min离心20min取上清。经BCA蛋白定量试剂盒定量后，各取50mg蛋白加入等体积1×SDS上样缓冲液，沸水浴10min变性蛋白质。行10%SDS-PAGE电泳，电泳结束后将上述蛋白转移至PVDF膜，抗体孵育后检测目的蛋白条带表达情况。

7.Real-time PCR检测相关mRNA表达:收集经紫杉醇诱导处理48h后的ESCC-CSCs细胞及对照组细胞，参照TRIzol试剂盒说明书提取细胞总RNA，反转录合成cDNAs，以GAPDH作为内参基因使用qRT-PCR试剂盒对待测mRNA进行定量扩增。PCR反应体系25μl，预设PCR反应条件为94℃预变性2min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，设置40次循环；扩增结束后设置95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s做溶解曲线。采用2-ΔΔCt相对定量分析方法检测细胞中相关mRNA表达水平。实验过程中每组样本配置3个副孔，取平均值记录分析，同时做阴性对照排除反应体系中PCR污染及引物二聚体干扰。

8.统计学方法:采用SPSS 19.0统计学软件对数据进行方差分析，并进行两两比较。所有细胞功能实验均重复3次，取平均值后进行数据分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

图1 ESCC-CSCs的分离及鉴定(荧光染色，×200)A、B.TE-13细胞系经荧光活化细胞分选：A.采用Hoechst33342标记分选的TE-13细胞中SP细胞约占29.3%；B.SP细胞与维拉帕米共孵育后，细胞所占比例降至1.3%；C～E.Hoechst与SOX2同时对分选出的细胞染色图像采集及组合；F～H.Hoechst与CD44同时对分选出的细胞染色图像采集及组合

结 果

1.ESCC-CSCs分选与鉴定:通过流式分选TE-13细胞中SP细胞群，如图1A、B所示，排除死细胞和细胞碎片，基于散射信号及PI荧光，筛选到SP细胞占总细胞数的29.3%；同时细胞与维拉帕米共孵育后，SP细胞所占比例仅为1.3%，由此说明细胞对Hoechst33342的排除是由维拉帕米敏感导致的。进一步通过免疫荧光染色鉴定分选所得细胞，Hoechst染色确定细胞核位置呈蓝色荧光，潜在的食管鳞癌干细胞特异性标志物CD44及SOX2用于表征ESCC-CSCs干细胞特性，CD44抗体呈绿色荧光，SOX2抗体呈红色荧光，同一视野下拍摄并组合Hoechst与二者荧光图片。如图1C～H所示，分选的SP细胞均表达SOX2及CD44，可以判断ESCC-CSCs细胞提取成功。

2.紫杉醇抑制ESCC-CSCs细胞增殖:CCK-8检测紫杉醇对ESCC-CSCs细胞体外增殖能力的影响，如图2所示，体外给予紫杉醇处理24h后，实验组较对照组细胞体外增殖能力开始受到显著抑制(P<0.01)，且随时间的增加，紫杉醇对ESCC-CSCs细胞增殖能力的抑制增强，与对照组比较，差异有统计学意义(P=0.000)。

图2 CCK-8检测紫杉醇对ESCC-CSCs体外增殖活力的影响与对照组比较，*P<0.01，**P=0.000

3.紫杉醇抑制ESCC-CSCs细胞克隆形成及体外成球:克隆形成实验进一步说明紫杉醇可以抑制ESCC-CSCs细胞体外增殖及克隆形成能力，如图3A～C所示，给予紫杉醇诱导后细胞体外增殖干性显著降低，克隆形成数量较对照组显著减少(P<0.01)；成球实验结果表明，在经紫杉醇处理后ESCC-CSCs细胞成球率SFE显著低于对照组细胞(P<0.01)，且观察到球体直径明显小于对照组细胞球，如图3D～F所示，由此说明紫杉醇抑制ESCC-CSCs细胞体外成球及自我更新能力。

图3 紫杉醇对ESCC-CSCs细胞克隆形成及体外成球能力的影响(×40)A～C.克隆形成检测对照组(A)和实验组(B)体外克隆形成情况及定量统计结果(C)；D～F.成球实验检测对照组(D)和实验组(E)体外干细胞成球能力及各组体外SFE统计结果(F)

4.紫杉醇抑制ESCC-CSCs细胞内TAZ、CD44、SOX2关键蛋白表达:Western blot法检测细胞内相关蛋白表达变化，如图4A、B所示，给予紫杉醇作用后ESCC-CSCs细胞内TAZ、CD44、SOX2蛋白表达水平显著降低，与对照组比较，差异有统计学意义(P=0.000)，反之磷酸化的TAZ(p-TAZ)较对照组蛋白表达量显著增加；qRT-PCR检测细胞内相关mRNA分子变化情况，如图4C显示，紫杉醇可显著抑制ESCC-CSCs细胞内CD44及SOX2 mRNA表达(P=0.000)，而对TAZ mRNA表达无显著影响。

图4 紫杉醇对ESCC-CSCs细胞内TAZ、CD44、SOX2等关键蛋白及mRNA表达的影响A、B.Western blot法检测ESCC-CSCs细胞内相关蛋白表达水平(A)及定量分析结果(B)；C.细胞内相关mRNA表达水平检测；与对照组比较，*P=0.000

讨 论

肿瘤干细胞(CSCs)是肿瘤中一群与正常组织干细胞具有相似功能，且具有长期自我更新及分化为子代细胞能力的细胞亚群，具有无限增殖、自我更新、多向分化的潜能[9，10]。近年来研究表明，CSCs能抵抗常规的放疗及化疗，参与肿瘤的化疗药物耐药等重要过程[11，12]。发现并识别多种肿瘤的干细胞及其作用机制为肿瘤的靶向治疗提供了新的方向。Hippo信号通路最早被发现可以通过抑制增殖和促进凋亡参与调控器官大小，并且具有高度的保守性，在人类及多种生物中都能找到相似功能的成员[13]。另一方面，近年来的研究表明Hippo作为抑肿瘤信号同时参与调控乳腺癌、肝癌等多种肿瘤干细胞的干细胞性能维持及癌症进程[14～16]。本研究旨在通过探究紫杉醇对ESCC-CSCs干细胞性能及相关Hippo信号分子变化，阐明紫杉醇干扰ESCC-CSCs细胞功能抑制食管癌的作用机制。

通过侧群细胞分离法对TE-13细胞系中可能存在的干细胞进行筛选，如图1所示，干细胞中含有的ABC转运蛋白家族中ABCG2(ATP-binding cassette superfamily G member 2)可将干细胞中Hoechst染料泵出胞内。因此，基于散射信号及PI荧光选定低Hoechst red信号、低Hoechst blue信号区域。同时，将细胞与维拉帕米共孵育后，维拉帕米发挥ABC家族蛋白抑制剂的作用，阻断由ABCG2引发的细胞外排Hoechst，选定维拉帕米缺失的区域，二者共同筛选得到SP细胞群，可认为是TE-13细胞系中具有干细胞特性的ESCC-CSCs细胞。进一步参考相关文献报道，选取CD44、SOX2为ESCC-CSCs细胞特异性标志物，检测筛选所得细胞中CD44、SOX2的表达，进一步确定所得ESCC-CSCs的干细胞特性[17，18]。通过体外给予紫杉醇诱导后，笔者分别从细胞增殖、克隆形成及成球实验3个方面观察到紫杉醇对ESCC-CSCs细胞干性存在显著抑制(图2、图3)，为进一步探究紫杉醇抑制ESCC-CSCs干细胞特性的分子机制，分别从mRNA及蛋白水平对Hippo信号通路关键蛋白TZA、干性调控因子SOX2、CD44的表达水平进行了检测，如图4所示，结果显示紫杉醇诱导细胞内TAZ、CD44及SOX2蛋白表达减少，同时p-TAZ表达增加，而TAZ mRNA表达不依赖紫杉醇诱导发生变化，CD44、SOX2 mRNA表达水平变化与蛋白表达变化一致，均受紫杉醇的抑制。

据相关文献报道，CD44、SOX2高表达于正常的干细胞中参与调控细胞干性的维持[18]。紫杉醇诱导后，细胞分裂受阻相关CD44、SOX2 mRNA分子转录受到抑制，进一步造成了蛋白水平CD44、SOX2表达的降低。另一方面，TAZ蛋白减少与其mRNA表达无关，推测紫杉醇可能通过激活Hippo信号抑制TAZ的功能。相关研究表明，伐地那非等药物可通过促进Hippo信号通路中MST和Lats的磷酸化进一步促进TAZ的S89位点的磷酸化，从而引起TAZ后续泛素化降解失活。因此，通过检测ESCC-CSCs细胞中p-TAZ蛋白表达量的变化，发现给予紫杉醇诱导后ESCC-CSCs细胞中TAZ磷酸化程度增加(p-TAZ表达增加)，与TAZ表达呈负相关，这提示在食管癌中紫杉醇可能通过激活Hippo信号中MST和Lats蛋白激酶活化进一步促进TAZ磷酸化，抑制TAZ转录活性和生物学功能的作用，最终发挥抑制ESCC-CSCs细胞干性的作用。

综上所述，笔者认为紫杉醇可通过作用于Hippo信号通路中TAZ、SOX2、CD44等关键分子蛋白，参与调控食管癌干细胞干性，抑制癌干细胞异常增殖和移植瘤的转移，但与此同时，Hippo中涉及的多种复杂的分子信号机制是否参与紫杉醇对ESCC-CSCs细胞干性的调控仍有待于开展多方面的深入研究。