对高效液相色谱法测定鲜活水产品中孔雀石绿残留量方法的优化

潘泉君

（北海市疾病预防控制中心 广西北海 536000）

1 前言

孔雀石绿（Malachite Green）是有毒的三苯甲烷类化学物质，既是染料，也是杀菌、除寄生虫的药物，但具有潜在的致癌作用，在水产养殖领域是国家明令禁止添加的物质[1]。目前，常用于检测鲜活水产品中孔雀石绿残留量的方法为GB/T 20361—2006《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法》的高效液相色谱荧光检测法[2]和GB/T 19857—2005《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》的液相色谱-串联质谱法[3]。前法所用仪器高效液相色谱较为普及，但前处理所用试剂种类较多、步骤烦琐，可能导致提取过程中孔雀石绿损失较大；后法前处理较为简单，但使用的液相色谱-串联质谱较为昂贵，且维护费用高，经济负担重。故本文结合上述2种方法的优点，对鲜活水产品中孔雀石绿残留量的测定方法进行改良。

2 原理

样品中残留的孔雀石绿用乙腈提取，氯化钠使乙腈和水相分层，取乙腈相浓缩后经固相萃取柱净化，液相荧光检测器检测，外标法定量。

3 材料与方法

3.1 仪器与试剂

仪器：Agilent 1200高效液相色谱仪（FLD检测器）；Agilent 1260自动进样器、超声波清洗仪（东莞市科桥超声波设备有限公司）；漩涡混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；感量0.01 g电子天平（奥豪斯仪器有限公司）；旋转蒸发仪（步琦公司）；高速离心机（山东鑫贝西生物技术有限公司）。

试剂：色谱纯乙腈；分析纯氯化钠；分析纯硼氢化钾（使用时称取0.405 g溶解于250 mL水中，此时浓度为0.03 mol/L，现配现用）；分析纯冰乙酸；分析纯无水乙酸铵（使用时称取9.64 g溶解于1 000 mL水中，此时浓度为0.125 mol/L，冰乙酸调pH到4.5）；中性氧化铝柱（CNW 公司，1 g/3 mL）；0.22 μm 滤膜（津腾公司）；100 mg/L乙腈中孔雀石绿标准溶液（中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所）。

3.2 方法

3.2.1 样品处理

将购于水产市场的活鱼活虾去鳞、去皮、去壳，取肌肉部分，将样品切成直径不大于0.1 cm的小块。准确称取样品5.00 g于50 mL具塞离心管中，加入10.0 mL乙腈和适量氯化钠，涡旋混匀，超声5min，4 000 r/min离心5 min，取上清液至梨形瓶中，加入10.0 mL乙腈至上述离心管中，捣碎沉淀后再次涡旋混匀，超声5 min，4 000 r/min离心5 min，合并上清液至梨形瓶中，旋转蒸发至剩余液体1 mL左右。转移残液至已用5 mL乙腈活化过的中性氧化铝柱上，用2.5 mL乙腈洗涤梨形瓶，洗涤液过柱。重复上述操作1次，收集全部流出液于另一梨形瓶中，再次旋转蒸发至1mL左右，加入硼氢化钾溶液（0.03mol/L）0.6mL，乙腈定容至3 mL，过0.22 μm滤膜后进样测定。

3.2.2 标准曲线配制（表1）

移取100 mg/L标准溶液1.00 mL至100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，此为标准中间液。移取表1中体积的标准中间液于10mL容量瓶中，各加入硼氢化钾溶液（0.03 mol/L）2 mL，用乙腈定容至刻度，配制成工作标准曲线。

表1 标准曲线配制一览表

3.2.3 色谱条件

采用ZORBAX Eplipse XDB-C18色谱柱，柱温35℃，流速：1.3mL/min，荧光检测器（FLD）检测器（激发波长：265nm，发射波长：360 nm），流动相为乙腈+乙酸铵缓冲溶液（0.125mol/L，pH4.5）=80+20，进样量 20L。

4 结果

4.1 系统适应性实验

分别取溶剂乙腈、孔雀石绿阴性样品、浓度为5.00 ng/mL的标准液在3.2.3色谱条件下测定，测定谱图详见图1～图3。在该色谱条件下，标准品峰型良好，乙腈和孔雀石绿阴性样品在与标准品的色谱峰相应的位置上无吸收峰，表明溶剂和样品基质中的其他成分对测定结果无影响。

图1 溶剂乙腈图谱

图2 孔雀石绿阴性样品图谱

图3 5.00 ng/mL的标准图谱

4.2 线性关系考察

按3.2.2下的方法配制标准溶液，在3.2.3色谱条件下测定，绘制标准曲线，结果详见表2。

表2 线性关系考察结果

4.3 加标回收率试验

称取上述已测定的阴性鱼、虾样品各6份，按高、中、低水平做加标回收试验，高、中、低水平的加入量分别为 6.00 ng、15.00 ng、30.00 ng，做平行样。按3.2.1进行样品处理，以外标法进行定量计算。加标样品测定图谱详见图4。

4.4 精密度试验

准确称取上述已测定的阴性样品5.00 g，加入孔雀石绿标准15.00 ng，按3.2.1进行样品处理，由自动进样器连续进样6次，用测得的峰面积求相对标准偏差（RSD）。

4.5 检出限试验

准确称取上述已测定的阴性样品5.00 g，加入孔雀石绿标准3.00 ng，按3.2.1进行样品处理，以3倍信噪比计算检出限。加标回收率、精密度以及检出限结果详见表3。

图4 加标样品图谱

表3 加标回收率、精密度及检出限结果

5 结论

（1）本方法准确快速，减少了国标方法前处理的烦琐操作，降低了实验所需花费，适用于测定鲜活水产品中孔雀石绿残留量；（2）氯化钠需加过量，否则乙腈中残留水分太多，加入硼氢化钾溶液后易起泡、易乳化，影响定容体积；（3）不宜将样品打成泥状使用，否则易黏结在一起，不利于样品均匀地涡旋和超声。