去乙酰化酶4在结直肠癌组织中的表达及其临床意义

王梦园 左维维 夏雨佳 胡明

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)发病率和死亡率分别高居所有恶性肿瘤的第3位和第2位[1]。有研究表明，CRC的发生发展、侵袭转移是一个多基因参与的过程，原癌基因和抑癌基因的失调扮演着重要角色[2]。Sirtuins(SIRTs)由SIRT1-7七个成员组成，广泛参与多种细胞过程[3]。有研究表明，SIRTs的异常表达与包括恶性肿瘤在内的多种人类疾病的发生、发展密切相关[4-5]。SIRT4作为去乙酰化酶家族中特征最不明显的成员之一，已被证实在包括乳腺癌、食管癌、胃癌和膀胱癌等多种实体恶性肿瘤中下调表达，且其表达强度与肿瘤的增殖、浸润和转移密切相关[6]。我们对SIRT4在CRC组织中的表达进行检测，并分析其与CRC病人临床病理特征及预后的相关性。

对象与方法

一、对象

2013年1月～2013年12月我院住院并接受手术治疗的CRC病人组织标本85例。入组标准：(1)均经组织病理学检查确诊为结直肠癌；(2)术前未接受过任何抗肿瘤治疗；(3)根据NCCN指南推荐，对术后病理分期为ⅡB和Ⅲ期的病人进行术后辅助治疗；(4)具有完整的临床病理资料和5年随访信息。排除标准：有远处转移；手术为非根治性手术。收集组织包括癌及其配对的癌旁组织(距离癌组织5 cm以上)，所有标本分成2份：1份放入液氮并迅速转移至-80℃冰箱冻存用于总RNA的提取；另1份放入10%的福尔马林溶液中固定用于免疫组化切片染色。85例CRC病人中，男性46例，女性39例；年龄38～81岁，平均年龄为(63.0±2.31)岁；按照UICC第7版CRC分期系统进行术后病理分期，其中Ⅰ期9例，Ⅱ期33例，Ⅲ期43例。体临床病理特征见表1。本研究已获得我院伦理委员会批准并获得病人知情同意。

二、方法

1.逆转录-聚合酶链反应：Trizol法提取细胞及组织中RNA，-80℃冰箱保存。取1ugRNA按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录反应合成互补脱氧核糖核酸(cDNA)，加入SYBR green染料(Qiagen)进行PCR扩增。实时荧光定量逆转录聚合酶链反应的条件为：95℃预变性30秒，之后95℃ 5秒，60℃ 30秒，共38个循环后进行溶解曲线检测，数据处理采用2-△△Ct法。

2.Western blot：细胞培养48小时后，吸弃上清液，收集细胞，加入细胞裂解液，提取总蛋白，应用BCA试剂盒对蛋白浓度进行检测。配制10%分离胶和5%浓缩胶，电泳转膜，5%脱脂牛奶封闭，置于鼠抗人SIRT4抗体(1∶3000稀释)或鼠抗人GAPDH(1∶1000稀释)中4℃孵育过夜孵育结束后，洗膜，再滴加兔抗鼠二抗室温摇床孵育1小时，再洗涤。将洗涤千净的PVDF膜置于ChemiDoc MP全能型凝胶成像分析系统仪器中扫膜，用Image Lab软件系处理图像即得到最终结果。

3.免疫组织化学染色：取组织石蜡切片常规脱蜡至水，3%H2O2去离子水(无色液体)孵育10～30分钟，以灭活内源性过氧化物酶活性。山羊血清封闭15～30分钟，孵SIRT4一抗(1∶200稀释)，37℃孵育2～3小时，次日滴加标记有HRP的二抗室温孵育30分钟，显色剂显色(DAB)，显微镜下控制反应时间。苏木素复染，逐级脱水、透明、中性树胶封片染色。根据每个高倍镜视野中阳性细胞所占比例进行评分。

表1 结直肠癌组织SIRT4表达与病人临床病理特征的关系(85例)

注：aP<0.05；bAJCC/UICC第七版TNM分期系统；CEA，癌胚抗原；CA199

4.随访：85例病人均获随访。采取门诊复查或电话随访方式，随访时间截止至2018年12月或者病人死亡。主要观察指标为无复发生存期(recurrence-free survival，RFS)和总生存期(overall survival，OS)。RFS：从接受根治性手术开始至疾病复发的时间；OS：从明确诊断为结直肠癌开始至因任何原因引起死亡的时间。

三、统计学方法

应用SPSS 23.0软件对数据进行分析。用配对Wilcoxon秩和检验比较SIRT4mRNA在癌与癌旁组织中的表达差异，用χ2检验分析CRC组织中SIRT4蛋白表达水平与病人临床病理特征的相关性，用Kaplan-Meier计算生存率并绘制生存曲线，组间生存差异采用Log-Rank检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.SIRT4在结直肠细胞中的表达：RT-qPCR结果显示，CRC细胞中SIRT4 mRNA的表达水平低于正常结直肠上皮细胞(P<0.05)(图1A)。Western blot检测结果表明，CRC细胞中SIRT4蛋白的表达水平也低于正常细胞(图1B)，与mRNA水平相符。同样，我们验证了SIRT4在CRC组织及癌旁组织中的表达情况，结果与细胞系中相似，SIRT4 mRNA 蛋白在CRC组织中的表达水平均低于相应的癌旁正常组织(P<0.05)(图1C和1D)。

2.SIRT4蛋白在结直肠癌组织中的表达：免疫组化检测结果显示，SIRT4蛋白定位于细胞质，根据表达强度的不同，可呈浅棕色至棕褐色颗粒(图2)。根据上述判定标准，在85例CRC病人中，SIRT4低表达49例，占57.6%。

3.SIRT4表达与结直肠癌病人临床病理特征的关系见表1。根据免疫组化染色结果，将85例结直肠癌病人分为高表达和低表达组，分析SIRT4表达水平与病人临床病理特征的相关性。结果表明，SIRT4蛋白的低表达与结直肠癌的组织分化程度、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、脉管浸润、神经侵犯及TNM分期显著相关(P<0.05)，与病人性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤大小及术前CEA水平无关(P>0.05)。

A，B：SIRT4 mRNA和蛋白在结直肠癌细胞和正常结直肠细胞中的表达；C，D：SIRT4 mRNA和蛋白在结直肠癌及对应的癌旁组织中的表达

A：低表达；B：高表达

4.SIRT4表达与结直肠癌病人预后的关系：所有85例CRC病人均获随访，结果发现，复发或转移57例(67.1%)，死亡53例(62.4%)。Kaplan-Meier 生存分析及Log-Rank检验结果见图3。结果显示，SIRT4蛋白表达水平越低，CRC病人的复发率和死亡率越高，差异有统计学意义(P<0.05)。提示结直肠癌组织中SIRT4的低表达与病人的不良预后显著相关。

讨 论

近年来，随着手术、放化疗及分子靶向治疗等治疗手段的不断发展与进步，从一定程度上改善了CRC的治疗效果和临床预后，但病人的5年生存率仍较低[7]。目前，复发转移仍是导致CRC病人死亡的首要原因[11]。当前已发现多个基因和信号通路在CRC的发生、进展和转移中发挥关键作用，但CRC的病因仍不明确[8]。因此，探究CRC潜在的分子机制可能为理解其发病机理提供新的见解，有助于发现新的潜在的生物标志物和治疗靶点。

A：复发；B：生存

图3结直肠癌组织中SIRT4表达强度与病人预后的关系

本研究结果表明，SIRT4在CRC细胞中的表达水平低于正常结直肠上皮细胞，同时，其在CRC组织中表达也低于邻近正常结直肠黏膜组织。进一步分析发现，SIRT4在CRC组织中的低表达不仅与肿瘤的分化程度、浸润深度、淋巴结转移、脉管浸润、神经侵犯及TNM分期等不良病理特征显著相关，也预示着病人的不良预后。上述研究结果提示，SIRT4可能在CRC的发生发展中扮演抑癌基因的角色。Gong等[9]通过分析TCGA数据库发现，在非小细胞肺癌中高表达，且SIRT4高表达与更长的生存时间相关。

有研究表明，肿瘤细胞的谷氨酰胺代谢和上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)与肿瘤的发生发展、侵袭转移密切相关[10-11]。Jeong等[12]揭示SIRT4可通过抑制线粒体的谷氨酰胺代谢，调节肿瘤细胞对DNA损伤的代谢反应，从而发挥抑癌活性。Miyo等[13]研究表明，SIRT4可通过抑制CRC细胞的谷氨酰胺代谢调节肿瘤细胞的EMT过程，从而抑制CRC细胞的增殖、迁移和侵袭。在胃癌中，SIRT4也被证实可通过调节肿瘤细胞的EMT进程进而抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭[14]。因此，我们推测SIRT4可能通过抑制肿瘤细胞的谷氨酰胺代谢和EMT进程，从而发挥抑癌活性。