池塘内循环流水养殖下太湖鲂鲌(翘嘴鲌(♀)×三角鲂(♂))肠道微生物群落变化的研究*

李 倩 郭建林 王雨辰 姜建湖 孙丽慧 宓国强 陈建明 顾志敏

池塘内循环流水养殖下太湖鲂鲌(翘嘴鲌(♀)×三角鲂(♂))肠道微生物群落变化的研究*

李 倩 郭建林①王雨辰 姜建湖 孙丽慧 宓国强 陈建明 顾志敏①

(浙江省淡水水产研究所 农业部淡水渔业健康养殖重点实验室 湖州 313001)

为研究池塘内循环流水养殖(In-pond Raceway, IPR)模式下太湖鲂鲌(翘嘴鲌(♀)×三角鲂(♂))肠道微生物群落结构的变化, 以传统池塘养殖作为对照组, 采用16S rRNA高通量测序方法分析了IPR养殖模式下太湖鲂鲌肠道的菌群结构及环境水体微生物多样性的变化。试验结果表明, IPR模式下太湖鲂鲌肠道微生物群落发生了明显的变化, 在门分类水平, 梭杆菌门(Fusobacteria)成为绝对优势菌, 所占丰度为92.47%; 对照组的优势菌由梭杆菌门、变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)组成, 三者所占的丰度分别为34.45%、33.30%和21.30%。在养殖水环境中, 两种养殖模式的微生物群落数均大于肠道样本, 且二者优势菌不同; IPR水环境的优势菌为蓝细菌(Cyanobacteria, 36.53%), 其次为放线菌门(Actinobacteria, 24.67%); 对照组水体中的优势菌为放线菌门和变形菌门, 分别占细菌总数的38.99%和28.15%。多样性指数结果表明, 水环境中的微生物群落Shannon多样性指数、Chao1指数高于肠道样本, IPR养殖对象肠道微生物群落多样性最低。本研究结果揭示, 池塘内循环流水高密度养殖模式下, 太湖鲂鲌的肠道微生物结构发生了一定的改变, 微生物群落多样性降低, 应注意该模式下养殖对象的肠道健康, 加强养殖管理。

太湖鲂鲌(翘嘴鲌(♀)×三角鲂()); 肠道微生物; 池塘内循环流水养殖(IPR); 高通量测序

池塘内循环流水养殖系统(in-pond raceway system, IPRS), 又称为跑道养殖系统, 2007年首次在美国阿拉巴马州的鲶鱼商业化养殖中获得成功(Brown, 2011)。该模式于2013年引进我国, 据统计, 截止2016年, 我国IPR面积约15.7ha, 并逐渐在江苏、浙江、安徽、上海等地推广应用(胡廷尖等, 2018)。池塘内循环流水养殖通过现代土建工程对传统养殖池塘进行改造, 其基本单元包括推水区、养殖区和净化区(金武等, 2015)。该模式具有养殖密度高、占地面积小、管理方便等优点, 已经在鲶鱼(Brown, 2011)、南美白对虾(廖思明等, 2006)、虹鳟(D’Orbcastel, 2009)等品种上成功应用。

池塘内循环流水养殖具有推水单元和不间断增氧的优点, 和传统池塘养殖相比, 养殖密度是后者的数十倍以上。在高密度养殖条件下, 养殖对象的肠道健康显得尤为重要。肠道微生物与养殖生物的健康有着密切的关系, 肠道菌群在宿主的代谢(Tremaroli, 2012)、生长(Turnbaugh, 2009; Zheng, 2016)和免疫(Qi, 2017)等方面发挥着重要作用, 是维持动物健康的必要因素。已有研究表明, 环境因子(Wang, 2014; Abdul, 2019)、养殖方式(刘瑞娟等, 2014; 尚碧娇等, 2018)、饲料营养(Ingerslev, 2014; Zheng, 2018)等因素会显著影响动物肠道微生物群落的组成。目前对池塘内循环流水养殖模式的研究主要集中在高产量、系统设计、养殖单元污染物的去除等方面, 而有关池塘内循环流水养殖对象肠道微生物方面的研究鲜有报道。

太湖鲂鲌(翘嘴鲌(♀)×三角鲂(♂))(femaleBasilewsky × male)是本所通过属间远缘杂交获得的新品种, 具有体型优(顾志敏等, 2008)、生长快(贾永义等, 2011)、肌间刺少(蒋文枰等, 2016)等杂种优势, 适合IPR高密度养殖, 具有较好的经济效益和较大的养殖前景。本研究以太湖鲂鲌为研究对象, 采用16S rRNA高通量测序技术, 对IPR养殖模式下太湖鲂鲌的肠道微生物和养殖水体环境微生物群落组成进行了分析, 并以普通池塘养殖为对照, 研究IPR养殖模式下太湖鲂鲌肠道菌群的变化, 为太湖鲂鲌肠道健康提供基础数据, 为IPR养殖管理提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 采样地点与时间

试验用IPR位于浙江省淡水水产研究所八里店综合试验基地, 长22m, 宽5m, 高2m, 实际水深1.5m。养殖对象为本所自主培育的太湖鲂鲌(femaleBasilewsky × male), 初始体重为517.15±12.79g, 放养密度为19.5kg/m3。对照组池塘面积1333.4m2, 养殖密度为1.29kg/m3, 初始体重和试验组相同。每天早晚各投喂一次, 投喂量为鱼体质量的2%, 养殖试验从2018年5月8日开始, 养殖时间90d, 试验结束时, IPR组平均体质量为(863.28±22.44)g, 对照组平均体质量为(1007.65±35.66)g。试验结束时, 用无菌剪刀将肠道组织剪开, 并用解剖刀轻轻刮取内溶物, 试验组和对照组随机采集鱼10尾, 将肠道内容物混合为一个样品。无菌方式采集试验组和对照池塘水样2L, 经0.22 μm滤膜过滤后, 所有样品保存于–80°C冰箱备用。

1.2 DNA提取及PCR扩增

无菌条件下取出滤膜, 剪碎后放置于1.5mL离心管中, 参照DNA提取试剂盒E.Z.N.A. Water DNA Kit (OMEGA Biotech, 美国)方法提取基因组DNA。称取1g肠道样品, 参照土壤核酸提取试剂盒(OMEGA Biotech, 美国)说明步骤提取肠道总DNA。16S rRNA基因测序以V3和V4区为目标设计引物, 引物序列为338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)。PCR采用TransGen AP221-02, 反应体系20μL: 5×FastPfu缓冲液4μL、2.5mmol/L dNTPs 2μL、5μmol/L上下游引物各0.8μL、Fast聚合酶0.4μL、BSA 0.2μL、DNA模板10ng, 补ddH2O至20μL。PCR反应条件: 95°C 3min; 95°C 30s, 53°C 45s, 72°C 1min, 28个循环; 72°C延伸10min。PCR反应在PCR反应仪9700 (Applied Biosystems®GeneAmp®, CA, 美国)上进行。扩增完成后的PCR产物使用Beads纯化之后进行上机测序, 测序委托上海美吉生物医药科技有限公司(上海, 中国)进行。

1.3 数据分析

对测序得到的原始数据, 首先根据PE reads之间的overlap关系进行拼接, 之后同时对reads的质量和拼接效果进行质控过滤, 根据序列首尾两端的barcode和引物序列区分样品得到有效序列, 并校正序列方向, 即为优化数据(Callahan, 2016)。对最终获得Clean数据归一化之后, 按照97%相似性进行OTUs (Operational taxonomic units, OTU)聚类分析和物种分类学分析。采用QIIME软件(http://qiime.org/ scripts/assign_taxonomy.html)对样品序列进行Alpha多样性分析, 采用Excel进行样品的柱状图、OTU稀释曲线图绘制, 采用R语言和Adobe Illustrator CS6软件绘制样品热图和Venn图。

2 结果与分析

2.1 测序质量分析

本试验总共获得226516条有效序列, 试验组和对照组获得的有效序列数分别为69300和52559, 对应养殖水体获得的有效序列数分别为58162和46495。利用测得序列中已知OTU的相对比例与其相对应的OTU数量的期望值构建稀释曲线, 结果显示, 各样品曲线都趋于平缓, 说明测序深度基本能够覆盖样品中的所有物种(图1)。

图1 肠道和水体样本菌群的OTU稀释性曲线图

注：G1、G2为IPR组和对照组鱼肠道样本, W1、W2为IPR组和对照组水体样本, 下同

2.2 微生物群落组成分析

将所有样本中相对丰度小于1%的物种归为其他, 图2为各样本在门分类水平的细菌群落组成图。在G1中, 梭杆菌门(Fusobacteria)为绝对优势菌, 所占丰度为92.47%; 在G2中, 优势菌有三个门, 分别为梭杆菌门、变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes), 三者的相对丰度分别为34.45%、33.30%和21.30%。对应养殖水体中的优势菌和肠道不同, W1中的优势菌为蓝细菌(Cyanobacteria), 相对丰度为36.53%, 其次为放线菌门(Actinobacteria; 24.67%)。W2中的优势菌为放线菌门和变形菌门, 分别占细菌总数的38.99%和28.15%。

图2 样品在门分类水平的细菌种群丰度图

与门水平相同, G1的绝对优势菌为梭杆菌纲(Fusobacteriia), 相对丰度为92.47%, G2的优势菌有3个, 分别为梭杆菌纲(Fusobacteriia)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、丹毒丝菌纲(Erysipelotrichia), 相对丰度分别为34.45%、29.02%、19.82%。水环境中的优势菌和肠道样本不同, W1中丰度排名靠前的为蓝细菌纲和放线菌纲(Actinobacteria), 所占比例为36.53%、24.67%; W2中丰度较高的前3个纲分别为放线菌纲、鞘脂杆菌纲(Sphingobacteriia)、β-变形菌纲(Betaproteobacteria), 所占比例分别为38.99%、11.56%、10.59% (表1)。

筛选出每个样本中相对丰度最高的前20种OTU所对应的细菌, 在属水平上对每个样品的细菌分布进行热图统计分析(图3)。结果表明, 两个肠道微生物样本优势菌相同, 均为鲸杆菌属(), 但所占比例不同。G1中鲸杆菌属为绝对优势菌, 所占丰度为91.67%, 而G2的优势菌除鲸杆菌属(34.43%)外, 还发现一定比例的弧菌()(26.08%)。在环境样本中, W1的优势菌为聚球藻()(29.28%)、(11.68%), W2中优势菌为(20.31%)。图顶端为样品间聚类关系树, 结果显示肠道样本聚为一支, 水体样本聚为另一支。此外, 在属水平出现了大量未能鉴别或无法分类的细菌。

表1 各样本在纲水平的细菌群落丰度表(%)

Tab.1 The relative abundance of bacterial communities in all the samples at class level (%)

注：将所有样本中相对丰度小于2%的种类归为其他

2.3 韦恩图分析

为详细分析环境和养殖对象肠道微生物的异同, 本研究采用Venn图分析了4个样本在OTU水平上的组成相似性及重叠情况。图4表明, 两个肠道样本G1和G2中分别有190个和352个OTUs, 共有的OTUs数为134个(图4a), 水体样本W1和W2分别有468和722个OTUs, 共有的OTUs数为416个(图4b)。从环境和养殖对象肠道微生物群落分析, W1和G1共有的OTUs为117个, G1中61.58%的OTUs可以在W1中找到(图4c), W2和G2共有的OTUs数为223个, G2中63.35%的OTUs可以在W2中找到(图4d)。共有OTUs数大小为, W1＆W2(416) > W2＆G2(223)G1＆G2 > (134) > W1＆G1(117)。

图3 各样品中丰度最高的前20种OTU分布的热图分析

注：数值经lg处理, 颜色条代表相对丰度大小

2.4 各样本微生物群落多样性分析

在97%相似性水平下共观测到1732个物种, 各样本多样性指数见表2。结果显示, 养殖水体中的OTU数、Chao1指数和香农多样性指数高于肠道样本。W2的微生物种类、多样性以及丰富度最高, G1物种数目和多样性则最低, 微生物群落均一性也最低。肠道样本中, G1微生物群落多样性指数低于对照组。

3 讨论

3.1 IPR养殖下太湖鲂鲌肠道微生物群落结构的变化

本研究采用细菌16S rRNA高通量测序技术分析了普通池塘和IPR中太湖鲂鲌肠道及养殖水体的微生物群落结构组成。结果表明, 与对照组相比, IPR组太湖鲂鲌肠道和养殖水体中的微生物多样性、菌群的均一性均降低, 优势菌所占比例发生较大改变。在属水平, IPR组鱼体肠道中, 鲸杆菌()成为绝对优势菌, 所占丰度为92.47%。鲸杆菌是一种兼性厌氧有益菌, 是许多鱼类肠道细菌群落的核心菌群, 涉及维生素B12的合成(Sugita, 1991; Tsuchiya, 2008)。有研究表明, 鱼体长期暴露在氨氮等胁迫性因子环境中时会产生氧化应激反应, 造成组织损伤和免疫毒性(Benli, 2008; Foss, 2009), 当水体中氨氮含量达到10mg/L时, 鲫鱼肠道中鲸杆菌的丰度显著增加, 其抗氧化酶相关基因表达上调(Qi, 2017)。IPR养殖密度高、投饵量大、水体中氨氮含量较高, 鱼体肠道菌群中鲸杆菌丰度的增加, 可能为抵抗氨氮胁迫造成的应激反应。同时, 本研究结果发现, 弧菌属()在对照组中相对丰度较高, 所占丰度为26.08%, 是第二优势菌, 这与前人的研究结果(许燕等, 2018)类似, 可能与养殖对象处于亚健康状态有关。本研究结果表明, 在门和目水平, IPR组太湖鲂鲌肠道中优势菌的种类结构变化较小, 但优势菌的相对丰度发生明显变化。在属水平, IPR组肠道微生物种类和丰度都发生了明显的改变, 说明IPR养殖环境对太湖鲂鲌的肠道细菌群落的结构产生了一定的影响, 但具体是哪些水环境因子对养殖对象的肠道菌群有显著影响, 有待进一步研究。

图4 肠道和水体微生物OTU韦恩图

注：图中数字为各组样本中OTU的数量

表2 各样本的细菌群落多样性指数

Tab.2 The diversity indices of bacterial communities in the gut and water samples

3.2 养殖环境和肠道微生物群落结构的关系

养殖环境中存在大量的微生物类群, 它们参与养殖系统的物质循环和水质调节, 并直接影响鱼类的健康状况(Cheng, 2015; 薛明等, 2017)。本研究中, 在不同的分类学水平上, 虽然两种养殖水体绝对优势菌的种类并不完全相同, 但是两者均有共同的优势菌。如在门分类水平, 两种养殖水体中的优势菌均含有放线菌; 在目和属水平, 两种养殖模式养殖水体中的优势菌包括弗兰克氏菌(Frankiales)和。Venn图结果表明, W1和W2具有416个共同的OTUs, W1中有57.62%的OTUs可以在W2中找到, 说明两种养殖模式水环境中的微生物群落结构有较高的相似性。从肠道微生物和养殖水体微生物群落分析, 在对照组中, W2和G2共有的OTUs占肠道微生物群落总数的63.35%。在试验组中, 二者共有的OTUs占肠道样本的61.58%, 说明养殖水体和肠道样本的微生物群落具有较高的相似性。

3.3 IPR对太湖鲂鲌肠道微生物群落结构多样性的影响

细菌多样性在维持生态功能方面有重要作用, 已有研究表明, 多样性的降低可能导致细菌群落功能稳定性的降低, 从而增加养殖生物患病的风险(刘晶晶等, 2010; Jones, 2010; 刘志刚等, 2018)。在对照组鱼体肠道中, 共发现了352个OTU, 然而在IPR组中, OTU数目仅有190个, 养殖对象肠道微生物群落Shannon多样性指数、Chao1指数发生明显的下降。从Simpson指数分析, IPR组对象肠道中Simpson指数大于对照组, 其值越大, 说明群落多样性越低, 与Shannon多样性指数相一致(表2)。这些结果均表明, 高密度的IPR养殖模式降低了养殖对象肠道微生物的多样性。在IPR组, 鱼体肠道中出现了大量的鲸杆菌属, 而变形菌门、厚壁菌门等种类的丰度降低, 同时, 条件致病菌气单胞菌属()所占丰度比例有所上升, 说明在高密度IPR养殖模式下, 养殖对象肠道微生物群落结构发生了一定的改变。已有报道表明(Xiong, 2015; 吴金凤等, 2016), 发病组动物肠道中细菌多样性相对于健康组有较大幅度的下降, 本研究样本虽然没有出现发病情况, 但IPR高密度养殖模式中鱼体肠道微生物群落的改变及多样性的降低可能是一种应激预警。

4 结论

本研究采用16S rRNA高通量测序方法研究了IPR高密度养殖模式下, 太湖鲂鲌肠道菌群的变化情况, 结果表明: IPR高密度养殖模式下, 太湖鲂鲌的肠道菌群结构发生了明显的变化, 同时, 鱼体肠道微生物的多样性降低。本研究结果提示, 池塘内循环流水高密度养殖要注意优化养殖密度、加强养殖管理, 预防因理化因子变化而导致大规模疾病的暴发。

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ON CHANGES OF INTESTINAL MICROBIOTA OF A NEW HYBRID STRAIN OF (FEMALE) × (MALE) REARED IN IN-POND RACEWAY AQUACULTURE SYSTEM

LI Qian, GUO Jian-Lin, WANG Yu-Chen, JIANG Jian-Hu, SUN Li-Hui, MI Guo-Qiang, CHEN Jian-Ming, GU Zhi-Min

(Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries,Agriculture Ministry Key Laboratory of Healthy Freshwater Aquaculture, Huzhou 313001, China)

To study the changes of intestinal microbiota in a new hybrid strain of (femaleBasilewsky × male) reared in an in-pond race (IPR) aquaculture system, 16S rRNA high-throughput sequencing method was used to analyze the microflora structure and diversity of intestinal tract and water samples while the common pond was used as a control group. Results show that the microbial structure of intestinal tract changed obviously in the IPR group and it was strongly dominated by Fusobacteria at phylum level, which occupied 92.47% of the total species. However, three dominant phyla were found in the control group, including Fusobacteria, Proteobacteria, and Firmicutes, with the abundance of 34.45%, 33.30% and 21.30%, respectively. The numbers of microflora in water samples were higher than that of intestinal samples, and their dominant phylum was different. Cyanobacteria was the most abundant phylum in the water of IPR, the relative abundance was 36.53%. Actinobacteria was the second dominant phylum, 24.67%. In contrast, Actinobacteria and Proteobacteria were the most abundant phyla in the control group and their relative abundances were 38.99% and 28.15%, respectively. The diversity index indicates that the Shannon index and Chao1 index were higher in water samples than in that of intestinal tract, and the value of the diversity index in the IPR intestinal sample was the lowest of the all samples. Results reveal that the structure of intestinal microflora in the IPR changed to a certain extent and the diversity of bacterial communities decreased obviously. Attention shall be paid to the intestinal health and culturing management of the IPR.

female× male; intestinal microbiota; in-pond raceway (IPR) aquaculture; high-throughput sequencing

* 浙江省重点研发计划项目, 2018C02033号; 浙江省重点研发计划项目, 2016C020551-1号; 湖州市自然科学基金项目, 2019YZ12号; 浙江省淡水水产研究所探索性颠覆性项目, 2019TSX06号。李 倩, 工程师, E-mail: 2008feelkaka@sina.com

郭建林, 高级工程师, E-mail: wavegjl@aliyun.com; 顾志敏, 研究员, E-mail: guzhimin2006@163.com

2019-12-19,

2020-01-18

S965.112

10.11693/hyhz20191200266