Box-Behnken响应面法优化威灵仙饮片的炮制工艺

张永妹， 蒋佳雯， 李 玲， 谭家华， 田源红， 罗 君*， 殷少文

(1.贵州中医药大学 第一附属医院， 贵州 贵阳 550001； 2.贵州中医药大学， 贵州 贵阳 550001； 3.贵阳市第三人民医院， 贵州 贵阳 550001)

威灵仙为毛茛科植物威灵仙(ClematischinensisOsbeck)、棉团铁线莲(ClematishexapetalaPall.)或东北铁线莲(ClematismanshuricaRupr.)的干燥根及根茎。威灵仙味辛、咸，性温，有小毒，归膀胱经，具有祛风湿、通经络、消骨鲠等功效，主要用于治疗痛风、风湿顽痹、腰膝冷痛、脚气、癥瘕、积聚、破伤风及诸骨哽咽等症[1]。其药理作用研究表明，威灵仙在抗氧化、降血压、降血糖、免疫抑制、利胆、镇痛抗炎、抗肿瘤、利尿及松弛平滑肌等方面表现出多种药理活性[2-5]。

威灵仙饮片在现行版药典的炮制工艺只有简单净制方法，但在全国各省均有地方特色的威灵仙饮片炮制工艺[6]。在贵州，据2005版《贵州省中药饮片炮制规范》记载的炮制方法为酒润麸炒[7]，该工艺存在涉及辅料较多、工序操作复杂且无具体工艺参数、炮制品质量参差不齐等问题，且目前未见关于酒润麸炒威灵仙工艺的研究报道。为此，笔者等采用Box-Behnken响应面试验设计法，优化威灵仙酒润麸炒饮片的炮制工艺，明确该炮制工艺参数，拟为贵州省威灵仙酒润麸炒饮片的开发与利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

药材：威灵仙，购买于同济堂药业(批号：20170201；产地：四川)。

试剂：齐墩果酸对照品(中国药品生物制品检定所，110709-201607，供薄层鉴别和含量测定用)，乙腈(色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司)，甲醇(色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司)，水为娃哈哈纯净水，黄酒(酒精度≥16.5%，浙江塔牌绍兴酒厂)；甲醇、乙酸乙酯、稀乙醇、乙腈等均为分析纯。

仪器：Thermo ultiMate 3000高效液相色谱仪(上海硅仪生化科技有限公司)，AUW 220D十万分之一电子天平(苏州岛津仪器有限公司)，METTLER TOLEDO ME204E万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)，TW-2000W型可控调温电炉(郫县永信电器厂)，HH-2数显恒温水浴锅(常州澳华仪器有限公司)，LDP-150高速多功能粉碎机(浙江永康市红太阳机电有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 炮制方法 取净威灵仙段，加适量黄酒拌匀，闷润一定时间，照麸炒法(附录一炮制通则)炒至表面淡黄色时取出，筛去蜜麸皮，放凉[6]。

1.2.2 齐墩果酸含量的测定 按照2015版药典规定，采用高效液相色谱法测定威灵仙中齐墩果酸的含量，作为优化酒润麸炒威灵仙饮片炮制工艺的评价指标。

1) 色谱条件。色谱柱：WondaSilC18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。以乙腈∶水=90∶10为流动相进行洗脱，检测波长为205 nm，柱温30℃，流速为1 mL/min，进样体积为10 μL。

2) 标准曲线的绘制及线性范围。制备浓度为1 mg/mL、0.7 mg/mL、0.64 mg/mL、0.5 mg/mL、0.448 mg/mL、0.33 mg/mL和0.25 mg/mL的齐墩果酸对照品溶液。以相同的体积10 μL依次进样，按1.2.2的1)项进行测定，以齐墩果酸对照品。溶液浓度(x)为横坐标，以齐墩果酸峰面积为纵坐标(y)制定标准曲线，得到相应的回归方程y=118.82x-0.045(R2=0.999 7)，表明齐墩果酸在2.5 ～10.0 μg范围内线性关系良好。

齐墩果酸含量=[10 000×(y+0.045)]/[(称样量×118.82)]×100%

3) 供试品溶液的制备。精密称取样品粉末(过四号筛)4 g置于索氏提取器中，加乙酸乙酯适量，加热回流3 h，弃去乙酸乙酯液，药渣挥干溶剂，连同滤纸筒转移至锥形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，过滤，精密量取续滤液25 mL，于99℃水浴上蒸干，残渣加2 mol/L盐酸溶液30 mL使溶解，加热回流2 h。立即冷却，移入分液漏斗中，用水10 mL分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中。加乙酸乙酯振摇提取3次，每次15 mL，合并乙酸乙酯液，70℃以下浓缩至近干，加甲醇溶解，转移至50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得供试品溶液[1]。

1.2.3 单因素试验 根据1.2.1的炮制方法，制备酒润麸炒威灵仙饮片，在预试验的基础上，分别考察黄酒用量、闷润时间、蜜麸用量、炒制温度及炒制时间等因素对酒润麸炒威灵仙饮片中齐墩果酸含量的影响。

1) 黄酒用量。取100 g威灵仙药材5份，黄酒用量分别为6%、9%、12%、15%和18%，固定闷润时间为12 h，用12%蜜麸于温度180℃下炒制10 min取出，筛去蜜麸皮，放凉，粉碎。

2) 闷润时间。取100 g威灵仙药材5份，在最佳黄酒用量下，分别闷润8 h、10 h、12 h、14 h和16 h，用12%蜜麸于温度180℃下炒制时间10 min取出，筛去蜜麸皮，放凉，粉碎。

3) 蜜麸用量。取100 g威灵仙药材5份，在最佳黄酒用量及闷润时间下，蜜麸用量分别为3%、6%、9%、12%和15%，于温度180℃下炒制10 min取出，筛去蜜麸皮，放凉，粉碎。

4) 炒制温度。取100 g威灵仙药材5份，在最佳黄酒用量、闷润时间及蜜麸用量下分别于140℃、160℃、180℃、200℃和220℃下炒制10 min取出，筛去蜜麸皮，放凉，粉碎。

5 ) 炒制时间。取100 g威灵仙药材5份，在最佳黄酒用量、闷润时间、蜜麸用量及炒制温度下分别炒制6 min、8 min、10 min、12 min和14 min，取出筛去蜜麸皮，放凉，粉碎。

1.2.4 响应面试验设计 由于不同炒制时间的威灵仙饮片中齐墩果酸含量差异较小，说明该因素对酒润麸炒威灵仙饮片炮制工艺没有影响，因此该因素不纳入响应面试验。在参考相关文献[8-12]及预试验和单因素试验考察的基础上，选择黄酒用量(A)、闷润时间(B)、蜜麸用量(C)和炒制温度(D)为考察因素，根据Box-Behnken的中心组合设计原理，采Design-Expert 8.0.6设计4因素3水平共29个处理的响应面试验，其中中心点试验5次重复；以色谱图中齐墩果酸的含量为响应值对酒润麸炒威灵仙饮片炮制工艺进行响应面优化，其因素与水平值设置见表1。

表1威灵仙饮片炮制工艺的响应面试验因素及水平

Table 1 Factor and level of response surface test for processing technology ofC.chinensisdecoction pieces

水平 Level蜜麸用量/% Honey bran dosage黄酒用量/% Rice wine dosage闷润时间/h Moistening time炒制温度/℃ Stir-baking temperature-196818001212102001151812220

1.2.5 最佳工艺的验证 取威灵仙药材3份，按响应面试验优选出来的工艺参数进行炮制。并测定齐墩果酸含量。

1.3 数据分析

采用SPSS20.0对数据进行方差分析，Design Expert 8.0.6 对响应面试验结果进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同因素对威灵仙饮片齐墩果酸含量的影响

从表2可知，随着黄酒用量及蜜麸用量的增加、闷润时间及炒制时间的延长及炒制温度的升高齐墩果酸含量均呈先升后降趋势。黄酒用量、闷润时间、蜜麸用量、炒制温度和炒制时间分别为12%、10 h、12%、200℃和14 min的威灵仙饮片齐墩果酸含量在各单因素处理中最高，分别为1.67%、1.70%、1.67%、1.75%和1.67%。

表2 不同因素下威灵仙饮片的齐墩果酸含量

2.2 威灵仙饮片的最佳炮制工艺

2.2.1 二次回归模型的建立 从表3可知，不同处理威灵仙饮片齐墩果酸含量。对其结果进行二次多项式回归拟合，得到回归模型为齐墩果酸含量=1.63-0.023A+0.013B+0.12C-0.016D+0.053AB+0.073AC+0.045AD-0.038BC+0.045BD-0.0075CD+0.028A2+0.13B2-0.29C2+0.072D2(R2=0.911 4)。经方差分析，回归模型P<0.000 1，说明模型极显著；失拟项P为0.062 7，不显著，对模型是有利的，无明显失拟因素存在，表明该回归模型的拟合情况良好，因此可用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析。此外，因素C、B2和C2为显著影响因素，其P值分别为0.000 3、0.002 2和< 0.000 1，说明对酒润麸炒威灵仙饮片中齐墩果酸含量影响较显著，其他项不显著。

表3 威灵仙饮片炮制工艺各处理的齐墩果酸含量

2.2.2 响应面分析 响应面图及等高线图反应2个变量对齐墩果酸含量的交互影响。从图1～3看出， BC交互的曲线最陡，说明对齐墩果酸含量的影响最显著； DC交互的曲线稍陡，说明影响较显著；AC交互的曲线趋于平缓，响应值变化较小，说明影响不显著。因素间交互作用的影响依次为BC>DC>AC。

2.2.3 最佳工艺及验证 用Box-Behnken响应面优化法预测最优工艺为蜜麸用量9.6%，黄酒用量6.49%，闷润10.48 h，炒制温度为181.5℃，预测含量为1.93%。考虑到实际操作方便，将威灵仙的酒麸制炮制工艺确定为取净威灵仙药材，加6%黄酒拌匀，闷润10 h后，晾干，称取10%蜜麸、于180℃温度下炒制，筛去蜜麸皮，放凉，即得。经测定，最佳工艺下3次重复的齐墩果酸含量分别为1.93%、1.89%和1.88%，平均为1.90%。非常接近Box-Behnken响应面优化法预测的含量值(1.93%)，说明优选出来的最佳工艺可靠。

3 结论与讨论

根据贵州省2005版的《贵州省中药饮片炮制规范》的炮制方法威灵仙酒润麸炒炮制工艺，将该工艺的影响因素暂定为黄酒用量、蜜麸用量、闷润时间、炒制温度和炒制时间，采用单因素试验方法对上述影响因素进行试验，结果表明，对威灵仙饮片中齐墩果酸含量影响较大的主要有黄酒用量、闷润时间、蜜麸用量、炒制温度4个因素，炒制时间对其含量没有影响，因此不纳入该工艺影响因素之内。在进行 Box-Benhnken响应面分析设计时，选择黄酒用量、闷润时间、蜜麸用量、炒制温度4个因素作为考察对象进行Box-Benhnken 4因素3水平的中心组合试验。

在前期试验中与传统的工艺优选方法进行对比研究发现，采用正交或均匀设计进行优化，而这2种设计的方法均是以线性数学模型进行拟合，虽具有试验次数少的优点，但精确度不高，所建立的数学模型预测性较差。Box-Benhnken响应面分析法采用多元二次方程拟合考察因素和响应值之间的函数关系，可得出影响因素和响应值之间的相互关系，最终优选出最优的工艺参数，该方法进一步提升了精准度，具有试验次数相对较少，效率更高，可预测的优点。

试验结果表明，威灵仙饮片的最佳炮制工艺为取净威灵仙药材100 g，加黄酒6%拌匀，闷润10 h后，称取10%蜜麸、于温度180℃下炒制，筛去蜜麸皮，放凉，即得。该饮片质量检测指标符合药典要求，且验证性试验结果也表明，实测值(1.9.%)和预测值(1.93%)非常接近，拟合的数学模型方程相关系数R2=0.911 4，可见，通过Box-Benhnken效应面优化酒润麸炒威灵仙饮片的炮制工艺方案设计是合理的。