两色金鸡菊中马里苷和黄诺玛苷的制备及其均匀性研究

张永威， 李新霞， 王敬伟， 李琳琳， 陶义存， 骆 新， 王丽凤， 毛新民,3

(新疆医科大学1药学院； 2基础医学院； 3中医学院， 乌鲁木齐 830011)

两色金鸡菊(CoreopsistrinctoriaNutt)属菊科一年生草本植物金鸡菊的干燥花蕾[1]，其中主要的成分为黄酮类、挥发油类、氨基酸类、多糖类、脂肪酸类等[2-4]，具有清热解毒、活血化瘀、抗血栓、降血糖等药理作用[5]。本课题组前期研究发现，两色金鸡菊乙醇提物乙酸乙酯萃取部位富含马里苷和黄诺玛苷[6-8]。本研究采用聚酰胺柱层析法分离黄诺玛苷和马里苷，经重结晶进行纯化，研究纯化物的均匀性，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器LC-20AB型高效液相色谱仪(日本岛津公司), 490-4D型血小板聚集仪(美国Chrono-log公司), BC-2300型准全自动三分群血液细胞分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司), CAMAG REPROS-TAR3型薄层色谱数码成像系统(瑞士卡玛公司), 硅胶G高效板(青岛海洋化工厂), IR-Prestige型红外光谱仪(日本岛津公司), ACQUITY○R TQD型质谱仪(美国Waters公司), Inova 600型核磁共振光谱分析仪(美国Varian公司)。

1.2 试药两色金鸡菊乙醇提物(ETE)由新疆医科大学药理教研室自制 (批号20150526), 2-氨基乙基联苯基硼酸酯 (美国Sigma公司, 批号D9754), 60～90目聚酰胺 (青岛海洋化工厂, 批号3180216), 甲醇 (美国Sigma公司, 批号A2754), 乙腈 (美国Sigma公司, 批号T6884)。

2 方法与结果

2.1 样品的提取分离方法称取两色金鸡菊花蕾10 kg，用55%的乙醇回流提取得到ETE，用乙酸乙酯对醇提物进行萃取，静置20 min，弃去乙酸乙酯萃取部位，即得乙酸乙酯萃余部位(AR)，AR用正丁醇进行萃取，静置20 min，弃去正丁醇萃余部位，将正丁醇萃取部位浓缩后湿法上样，经聚酰胺柱层析吸附12 h，用纯化水按5 BV洗脱后，再分别用(10%，20%，30%，40%，95%)乙醇按3 BV洗脱，将10%乙醇部位经TLC法追踪得到黄诺玛苷，将40%乙醇洗脱液经TLC法追踪得到马里苷。

2.2 样品的纯化方法称取黄诺玛苷3 g加入DMSO超声20 min，使黄诺玛苷完全溶解，静置2 h,加1 000 mL纯化水置于锥形瓶中，避光静置2 d，待结晶析出完全，抽滤，真空干燥5 h，纯化得率为50%。称取马里苷1 g加入色谱甲醇超声20 min，使马里苷完全溶解，静置2 h，加800 mL纯化水置于锥形瓶中，避光静置2 d，待结晶析出完全，抽滤，真空干燥7 h，纯化得率为56%。

2.3 HPLC色谱鉴别黄诺玛苷色谱条件：Shim-pack VP-ODS色谱柱(150 mm×4.6 mm,5 μm),流速1.0 mL/min,检测波长280 nm,柱温35 ℃,进样量10 μL,流动相0.5%甲酸水溶液-乙腈(85∶15)梯度洗脱，在6.6 min处出峰。马里苷色谱条件：Shim-pack VP-ODS色谱柱(150 mm×4.6 mm,5μm )，流速1.0 mL/min，检测波长378 nm，柱温35℃，进样量10 μL，流动相0.5%甲酸水溶液-乙腈(80∶20)，梯度洗脱，在7.8 min处出峰，见图1、2。

图1 黄诺玛苷标准品HPLC色谱图

图2 马里苷标准品HPLC色谱图

2.4 TLC色谱鉴别分别称取黄诺玛苷对照品和马里苷对照品1 mg， 用甲醇制成浓度为 0.2 mg/mL的马里苷对照品溶液和黄诺玛苷对照品溶液，展开剂为甲苯-乙酸乙酯-甲酸( 9∶7∶3) ，将对照品溶液和样品溶液分别点于硅胶板上，以NP和PEG为展开剂展开，取出，晾干后，分别于366 nm和白光下进行荧光检测，结果黄诺玛苷样品与黄诺玛苷对照品，马里苷样品与马里苷对照品的比移值一致，见图3、4。

图3 黄诺玛苷和马里苷 TLC视检图(366 nm)

图4 黄诺玛苷和马里苷 TLC视检图(白光)

2.5 样品的纯度测定按“2.3”项下色谱条件采用面积归一化法测定，自制样品中黄诺玛苷和马里苷的纯度分别为99.6%和98.4%。

2.6 核磁鉴别

2.6.1 黄诺玛苷 淡黄色粉末；熔点：240～242℃；1H NMR (DMSO-d6, 600 MHz) δ:9.01 (1H, s, 4′-OH), 9.05 (1H, s, 8-OH), 8.52 (1H, s, 3′-OH), 7.23 (1H, dd, J=8.4 Hz, H-5), 6.86 (1H, d, J=8.4 Hz, H-6), 6.91 (1H, d, J=1.8Hz, H-2′), 6.78 (1H, d, J=7.8, 1.8 Hz, H-6′), 6.74 (1H, d, J=7.8 Hz, H-5′), 5.39 (1H, dd, J=12.6, 3.0 Hz, H-2), 2.68 (1H, dd, J=16.8, 3.6 Hz, H-3α), 3.11 (1H, dd, J=16.8, 12.6 Hz, H-3β), 4.81 (1H, d, J=7.8 Hz, H-1″); 13C NMR (DMSO-d6, 150 MHz) δ:79.2 (C-2), 43.4 (C-3), 191.1 (C-4), 118.0 (C-5), 109.0 (C-6), 150.7 (C-7), 135.1 (C-8), 150.5 (C-9), 114.5 (C-10), 129.9 (C-2′), 115.2 (C-2′), 145.1 (C-3′), 145.2 (C-4′), 116.5 (C-5′), 116.5 (C-6′), 101.5 (C-1″), 73.2 (C-2″), 77.3 (C-3″), 69.5 (C-4″), 75.7 (C-5″), 60.6 (C-6″)，以上理化性质与波谱数据与文献报道[9]一致,确定为黄诺玛苷。

2.6.2 黄诺玛苷 橘黄色粉末；熔点：197～200℃；1H NMR (DMSO-d6, 600 MHz) δ:13.21 (1H, s, 2′-OH), 9.81 (1H, s, 4-OH), 9.11 (1H, s, 3-OH), 8.48(1H, s, 3′-OH),7.78(1H, d, J=8.0 Hz, H-6′),7.70(1H, d, H-β),7.70(1H, d, H-α), 7.29 (1H, brs, H-2), 7.24 (1H, dd, J=8.4 Hz, H-6), 6.82 (1H, d, J=8.4 Hz, H-5), 6.76 (1H, d, J=8.0 Hz, H-5′), 4.92 (1H, d, J=6.0Hz, H-1″); 13C NMR (DMSO-d6, 150 MHz) δ:126.2 (C-1) , 116.0 (C-2), 145.6 (C-3), 149.1 (C-4), 115.8 (C-5), 122.6 (C-6), 192.7 (C=O), 145.3 (C-β), 118.7 (C-α), 115.7 (C-1′), 152.5 (C-2′), 134.5 (C-3′), 150.6 (C-4′), 106.5 (C-5′), 121.6 (C-6′), 100.9 (C-1″), 73.2 (C-2″), 77.4 (C-3″), 69.8 (C-4″), 75.9 (C-5″), 60.7 (C-6″)，以上理化性质与波谱数据与文献报道[10]一致,确定为马里苷。

2.7 黄诺玛苷和马里苷的均匀性检验将自制的马里苷和黄诺玛苷样品按25 mg/瓶分装100瓶，随机各抽取10瓶, 参照文献[11-12]方法进行均匀性检验, 每瓶样品各抽取3份子样, 按“2.3”项下色谱条件测定，对测得数据参照文献[13-14]方法进行标准偏差分析，结果马里苷样品间均匀性标准偏差为0.07，不均匀性不确定度为0.07；黄诺玛苷样品瓶间均匀性标准偏差为 0.06，不均匀性不确定度为0.06。两种样品瓶间均匀性标准偏差与不均匀性不确定度相近，认为被抽检的马里苷和黄诺玛苷样品均匀，见表1、2。

表1 马里苷样品的均匀性检测

表2 黄诺玛苷样品的均匀性检测

3 讨论

不同于其他单纯提取分离黄诺玛苷和马里苷的研究[15-16]，本研究定位于研制备马里苷和黄诺玛苷的标准样品，探寻一种单体产率相对较高，操作工艺简便的制备工艺，经过多种柱层析填料筛选，最终确定聚酰胺对乙酸乙酯萃余物的分离效果较好，黄诺玛苷和马里苷纯度能够达到98%以上。样品的纯度检测为其标准样品研制提供了重要的检测依据[17-18]，本研究建立了快速测定马里苷和黄诺玛苷的高效液相色谱条件，马里苷和黄诺玛苷样品的均匀性均符合国家标准样品的分装、取样和测得要求[19-20]，本研究为黄诺玛苷和马里苷标准样品的研制及相关药物的开发提供了工艺基础。