129例辅助生殖技术子代儿童耳聋基因突变筛查

孟晔，陶媛媛，胡馨，桑美英，童先宏

随着现代社会发展，不孕不育症的发病率呈日益上升趋势，世界卫生组织的统计结果显示10%～15%的育龄夫妇受到不孕症的困扰[1]。人类辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART）在一定程度上解决了多数不孕不育患者的生育问题，但ART子代健康问题备受关注，已有研究表明ART子代可能会出现血脂代谢及甲状腺代谢异常等倾向[2-3]。ART子代安全性一直是学者们关注的焦点[4]。

听力障碍会严重影响人类的生活，根据世界卫生组织的分级标准，当听力损失超过40 dB及以上时，定义为耳聋[5]。耳聋是常见的感觉功能障碍，也是常见的致残疾病。我国目前约有2 780万听力残疾人，占各类残疾之首[6-7]。由于人口基数巨大，我国每年大概新增6万～8万耳聋人口，耳聋发病率约1‰～3‰[8]。但ART本身是否对儿童听力造成影响尚无明确的定论。

Ludwig等[9]对采用胞浆内单精子注射（intracytoplasmic sperminjection，ICSI）助孕出生的儿童进行详细的听力和视力检查，并与自然妊娠出生的儿童进行比较，未发现显著差别。然而Yasemin等[10]回顾性分析246例ICSI助孕出生儿童，未能通过听力筛查的比例为4%，是自然妊娠出生婴儿的10倍，在排除可能影响听力的因素后，仍有5名儿童未能通过听力筛查（发生率为2%），认为ART是新生儿耳聋的危险因素。

耳聋的发病原因包括遗传因素和环境因素，其中遗传因素是耳聋的主要因素。遗传性耳聋分为常染色体隐性遗传、常染色体显性遗传、性染色体遗传和线粒体遗传等。按其表现分为综合征性耳聋和非综合征性耳聋[11]，其中以非综合征性耳聋为主，表现为除耳聋症状外不伴有其他临床症状[12]。现阶段已有临床研究证实基因突变是引起非综合征性耳聋的主要原因，中国人主要的遗传性耳聋致病基因有4个，分别为GJB2、GJB3、SLC26A4和MT-RNR1（12S rRNA）[13-16]。通过高通量测序技术筛查迟发性遗传性耳聋基因突变儿童，早期干预指导，预防遗传学耳聋的发生对提高后期生活质量具有重要意义。

本研究旨在了解ART子代儿童耳聋基因致病位点的分布和发病情况。标本获取困难且珍贵，本研究通过电话或信件等方式回顾性随访，共随机邀请了ART子代儿童129例，来院进行随访并采集外周血进行耳聋相关基因检测。通过初步基因筛查，建立科学的预测模型，为ART子代耳聋防控提供数据支持。

1 对象与方法

1.1 研究对象 本研究于2017年1月—2018年12月开展，通过电话、短信及信件等形式通知在中国科学技术大学附属第一医院生殖中心（本中心）通过ART助孕成功的子代来院随访。本研究共随访到129例ART子代为研究对象，受试时平均年龄为（4.37±0.92）岁。同时选取自然妊娠出生的161例子代作为对照组。纳入标准：①孕周38～41周足月分娩；②出生时体质量≥2 500 g；③出生后3 min Apgar评分＞8分。排除标准：①早产、低出生体质量儿；②家属拒绝参与本次研究。2组子代均于出生时常规使用Accuscreen TM型MADSEN听力筛查仪进行耳声发射听力筛查。本研究在获取中国科学技术大学附属第一医院伦理委员会批准的前提下开展，患儿家属均已签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 耳聋基因测序原理根据我国遗传性耳聋基因热点突变位点序列信息 [GJB2基因5个位点；GJB3基因2个位点；SLC26A4（PDS）基因11个位点；MT-RNR1（12SrRNA）基因2个位点]共4个基因20个位点，设计特异性扩增引物，利用多重聚合酶链反应（PCR）技术扩增富集人基因组DNA中靶序列，并同时引入用于样本识别的样本标签序列，见表1。

表1 遗传学耳聋筛查的20个基因位点

1.2.2 仪器和试剂PCR仪（PTC-200）购自美国Bio-Rad公司，PCR仪（ABI 9700）购自美国ABI公司，测序采用华大基因ISEQ-100测序仪，T4 DNA聚合酶、T4 DNA连接酶及Klenow（3’-5’exo-）购自Enzymatics公司。

1.2.3 操作方法研究对象来院后，填好信息表并进行编号，采用EDTA抗凝管采集外周静脉血2 mL。离心分离血浆和血细胞，放置-20℃干冰运输盒运送至实验室。实验人员通过对样本的外观及送检信息进行初步检查后入库至实验室信息管理系统。使用DNA提取试剂盒提取DNA，利用多重PCR原理扩增目的DNA序列。在多种DNA聚合酶、连接酶作用下对PCR产物进行末端补平、3’端加“A”，完成特殊接头在PCR产物两端的连接，经过磁珠纯化完成文库的制备。应用qPCR技术进行文库定量，根据文库定量结果将多个文库混合为1个上机文库。严格执行高通量测序仪的操作规范，获取序列碱基信息。基因测序仪对测序样本DNA进行序列信息读取，将数据拆分至每个子文库再拆分到单个样本，对4个耳聋基因的20个突变位点进行数据分析，从而确定20个突变位点的检测结果。

1.3 统计学方法 采用SPSS22.0统计学软件进行统计分析。定性资料用例（%）表示，组间比较用卡方检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ART子代与自然妊娠子代的耳聋基因突变比较 本研究共随访129例ART子代，男女比例为70∶59，发现11例（8.53%）携带耳聋基因突变，包含共12个基因位点的突变，而随访的161例自然妊娠子代，男女比例为91∶70，发现9例（5.59%）儿童携带耳聋基因突变。2组耳聋基因突变发生率比较，差异无统计学意义（χ2=0.962，P=0.327）。2组的性别比例差异无统计学意义（χ2=0.148，P=0.701）。2组耳声发射听力筛查均未发现听力障碍。

2.2 ART子代儿童的遗传学耳聋基因突变筛查结果 129例ART子代中GJB2突变携带者2例（1.55%），男女比例为1∶1；GJB3突变携带者3例（2.33%），男女比例为1∶2；SLC26A4突变携带者7例（5.43%），男女比例为5∶2；未发现线粒体12SrRNA基因突变携带者。1例有GJB2基因235delC位点和SLC26A4基因IVS7-2A＞G位点双杂合突变。本研究发现的所有突变位点均为杂合突变，SLC26A4（PDS）的IVS7-2A＞G位点突变阳性率最高，为4.65%。见表2。而161例自然妊娠子代以GJB2基因235delC位点突变阳性率最高，为55.55%。

2.3 ART子代儿童遗传性耳聋突变基因构成比 本研究筛查的11例ART子代儿童携带耳聋基因突变，包含共12个基因位点的突变，SLC26A4（PDS）基因突变构成比最高，为58.33%（7/12）；而GJB2基因突变构成比为16.67%（2/12），GJB3基因突变构成比为25.00%（3/12），MT-RNR1（12SrRNA）的基因构成比为0。

表2 129例ART子代儿童的遗传学耳聋基因突变筛查结果

2.4 不同助孕方式的ART子代儿童遗传性耳聋基因位点突变发生率比较 ART根据受精方式的不同可分为体外受精（IVF）和ICSI，根据移植胚胎的不同可分为新鲜胚胎移植或冻融胚胎移植。IVF子代耳聋基因位点突变发生率为11.83%（11/93），ICSI子代耳聋基因位点突变发生率为2.78%（1/36），2组比较差异无统计学意义（χ2=2.520，P=0.112）；新鲜胚胎移植子代耳聋基因位点突变发生率为11.39%（9/79），冷冻胚胎移植子代耳聋基因位点突变发生率为6.00%（3/50），2组比较差异无统计学意义（χ2=1.055，P=0.304）。

3 讨论

ART的应用日益普遍，解决了不孕不育夫妇的生育需求，随之ART出生儿童在社会总人口中的比例不断增大。由于ART的子代在助孕过程中经历了一系列超促排卵、配子及胚胎体外发育、冷冻、解冻等体外操作，理论上ART较之自然受孕的子代存在诸多风险。本研究通过高通量测序技术筛查了129例ART子代的遗传性耳聋基因突变情况，突变发生率为8.53%，高于161例自然妊娠子代的突变发生率（5.59%），但2组比较差异无统计学意义。已有的研究表明新生儿遗传性耳聋筛查基因突变发生率约为4.11%～4.68%[17-18]。Yasemin等[10]的回顾性分析亦表明在排除可能影响听力的因素后，ART是新生儿耳聋的危险因素。

本研究共发现11例ART子代儿童携带耳聋基因突变，包含12个基因位点的突变，GJB2、GJB3、SLC26A4及线粒体12SrRNA的基因突变发生率分别为1.55%、2.33%、5.43%和0。其中SLC26A4突变发生率最高，自然妊娠子代以GJB2基因突变发生率最高。已有的研究发现遗传性耳聋中GJB2基因突变发生率最高，占50%[19]，这与本研究自然妊娠组的结果相似。SLC26A4基因位于7号染色体，一般为常染色体隐性遗传，其编码pendrin跨膜蛋白，主要在内耳和甲状腺表达[20]。SLC26A4基因的突变可导致前庭水管扩大和感音神经性聋，与大前庭水管综合征密切相关[21]。已有研究表明SLC26A4基因以IVS7-2位点突变率最高[22]，这与本研究结果一致，本研究中SLC26A4基因的IVS7-2位点突变发生率最高，为4.65%。对于SLC26A4基因突变携带者要避免颅压增大和使用耳毒性药物，减少致聋发生。而线粒体12S rRNA基因的遗传方式表现为母系遗传，它是与氨基糖苷类抗生素致聋相关的基因，其突变会导致药物性聋[23]，本研究的ART子代儿童中尚未发现该基因的突变。

ART中的促排卵、胚胎IVF、培养、冷冻、解冻等操作过程对胚胎的发育均产生较大的影响，是否对耳聋相关基因造成影响相关的报道较少。Knoester等[24]比较ICSI、IVF和自然妊娠者的围生期结局及子代儿童的健康发育等情况，认为除了ICSI的围生期结局存在差异外，子代儿童的健康发育并没有差异。Belva等[25]也曾通过问卷调查的形式比较ICSI和自然妊娠出生儿童的先天畸形发生率，发现ICSI助孕儿童的先天小畸形发生率高达24.1%，其中听力系统结构异常占4.13%。Hassanane等[26]曾报道在一定的条件下，例如一定浓度的二甲基亚砜、外源DNA和精子共同孵育，可以依赖精子受精过程将外源DNA转移入卵子，产生转基因胚胎。本研究比较了IVF与ICSI以及新鲜胚胎移植与冻融胚胎移植的子代儿童的遗传性耳聋基因突变发生率，差异均无统计学意义，提示胚胎体外受精、冷冻、解冻等体外操作过程对耳聋相关基因未造成显著影响。

由于当今社会对ART仍认识不足，许多夫妻通过ART妊娠后出于自我保护不愿让外人知道，所以更换家庭住址、电话号码、甚至工作单位，这给随访工作带来困难。本研究中的随访对象为2010年1月—2014年12月行ART的母亲和子代，至今已有5～9年，失访率较高，共随访到129例ART子代，随访率为15%，占本中心同期出生儿童的4.43%。本研究中129例ART子代儿童的遗传性耳聋基因突变发生率高，且均为杂合突变。有研究表明突变杂合子罹患耳聋的风险可高达10%～20%[27]，然而本研究的11例携带者均未发生听力障碍，但更远期的影响尚未明确，因此ART子代安全性问题是一项长期的研究，后续关于ART子代成年期以及子二代的健康发育研究是有必要的，任重道远。

总之，本研究采用高通量测序方法检测遗传性耳聋基因突变发生率，对129例ART子代儿童GJB2、GJB3、SLC26A4和12SrRNA基因常见致聋位点进行筛查和结果统计，初步获得了ART子代儿童遗传性耳聋基因突变发生率，为预估ART子代每年患病人数提供数据支持，可为基因突变患者提供专业的治疗和指导，有针对性地提示ART子代耳聋基因防控重点。