不同程度心理应激对小鼠卵巢内氧化应激水平的影响

程蕊，刘妍，杨慧，马瑞红，夏天

近年日趋激烈的社会竞争和日益加快的生活节奏，使越来越多的人们处于心理应激状态，尤其现代女性在社会中角色的改变，在工作、家庭、生活上的压力逐渐增加，更多的育龄期女性因心理压力而患不孕症。心理应激（psychological stress）可干扰下丘脑-垂体-卵巢轴，引起内分泌功能的紊乱，从而严重影响女性的生殖功能[1]，包括不孕症、异常子宫出血、闭经等妇科疾病[2]。有研究表明，女性孕前较高的心理应激水平与不孕症的发生有直接关系[3]，而抑郁、焦虑和紧张是不孕症患者最常见的心理应激负性情感反应[4]。心理应激通过诱导产生活性氧（reactive oxygen species，ROS），从而引起氧化应激（oxidation stress，OS）而影响生殖健康[5]。若机体受到内外各种因素（接触放射性物质、心理应激、感染等）的影响，刺激机体产生过量的ROS，超出机体清除ROS的最大负荷量，则会引发氧化应激反应，进而造成细胞膜的损伤、DNA破坏等严重危害[6-7]。本实验研究心理应激小鼠通过卵巢内氧化应激反应影响生殖功能，为临床研究女性生殖疾病提供新的方向。

1 资料与方法

1.1 实验动物及分组 4～5周龄健康雌性未孕的SPF级ICR小鼠，体质量22～26 g，购自北京斯贝福生物技术有限公司。动物购入后适应性喂养1～2 d，连续7 d做阴道涂片，有正常动情周期的小鼠纳入研究。将80只雌性小鼠随机分为4组，每组20只，即正常组、心理应激强刺激组、心理应激中刺激组、心理应激弱刺激组。

药品及试剂：丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、ROS、SOD2、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所生产），TRIZOL、UltraPure Agarose、SuperScriptⅢRT反转录kit、SYBRqPCRMix（美国Invitrogen公司生产），无水乙醇、异丙醇（国药生产），焦碳酸二乙酯（DEPC，美国sigma-Aldrich公司生产）。

1.2 方法

1.2.1 造模参照Willner等（1991）的方法，并加以改进。随机给予小鼠慢性不可预见性应激，刺激方法包括：①禁水24 h；②禁食24 h；③夹尾10 min；④持续一整夜光照；⑤湿垫24 h；⑥束缚30 min；⑦冰水游泳5 min。以上刺激无规律进行，避免一种刺激连续或有规律地出现，使动物难以预知下次的刺激，连续刺激4周。

实验组按照心理应激模型制备方法，给予不同程度且不可预知性刺激。正常组：不给予任何干预；心理应激强刺激组：一日给予2次不同的刺激；心理应激中刺激组：一日给予1次不同的刺激；心理应激弱刺激组：隔日给予一次不同的刺激。各组4周后同时结束实验。

1.2.2 指标检测记录各组小鼠刺激前与刺激4周后体质量的变化；以及各组小鼠在旷场中随机3 min内小鼠的不动时间、进入中央区域的次数、中央区域活动时间、中央区域滞留时间的变化，以证实心理应激小鼠模型制备是否成功。

连续刺激4周，在末次刺激24 h后，从内眦静脉丛取血，检测小鼠血清ROS水平及SOD含量；然后将小鼠断颈处死，剖腹取卵巢，按照相应检测指标的规定放置标本并送检。

心理应激小鼠造模成功后，采用黄嘌呤氧化酶法测定各组小鼠血清中SOD含量、采用比色法测定小鼠血清中ROS水平；采用黄嘌呤氧化酶法测定各组小鼠卵巢组织中SOD活性、采用硫代巴比妥酸（TBA）法测定各组小鼠卵巢组织中MDA含量；采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法测定各组小鼠卵巢组织中SOD2、CAT、GSH-Px三种抗氧化酶的mRNA水平，以研究不同程度的心理应激对小鼠卵巢内氧化应激的影响。

1.3 统计学方法 所有实验数据均采用SPSS21.0统计软件进行分析。定量资料符合正态分布以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较方差齐时采用LSD检验，方差不齐时采用Dunnett’s T3检验。定量资料不符合正态分布时，以中位数和四分位数[M（P25，P75）]表示，组间比较及组间两两比较采用Kruskal-Wallis H检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠刺激前后体质量比较 各组小鼠刺激前体质量比较差异无统计学意义（P＞0.05）。刺激4周后，4组小鼠体质量比较差异有统计学意义（P＜0.05）；进一步两两比较显示，随着刺激强度的增加，小鼠体质量增长缓慢，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组小鼠刺激前后体质量比较 （g，x±s）

2.2 各组小鼠刺激后旷场试验指标比较 刺激4周后，旷场试验中4组小鼠的不动时间、进入中央区域次数、中央区域活动时间、中央区域滞留时间比较差异有统计学意义（P＜0.05），进一步两两比较显示，随着刺激强度的增加，小鼠不动时间延长，进入中央区域次数逐渐减少，差异均有统计学意义（P＜0.05）。强刺激组和中刺激组的中央区域活动时间低于正常组和弱刺激组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。强刺激组中央区域滞留时间高于正常组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

2.3 各组小鼠血清中ROS和SOD水平比较 4组小鼠血清中ROS水平和SOD含量比较差异有统计学意义（P＜0.05）；进一步两两比较显示，随着刺激强度的增加，小鼠血清中ROS水平逐渐升高，SOD含量逐渐降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

2.4 各组小鼠卵巢组织中SOD活性和MDA含量比较 4组小鼠卵巢组织中SOD活性和MDA含量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；进一步两两比较显示，随着刺激强度的增加，小鼠卵巢组织中SOD活性逐渐降低，MDA含量逐渐升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

2.5 各组小鼠卵巢组织中SOD2、CAT、GSH-Px的mRNA含量比较 4组小鼠卵巢组织中SOD2、CAT、GSH-Px表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；进一步两两比较显示，随着刺激强度的增加，小鼠卵巢组织中SOD2和CAT活性降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。强、中刺激组GSH-Px表达水平低于正常组，而中、弱刺激组GSH-Px表达水平高于强刺激组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表5。

表2 各组小鼠旷场试验中指标比较

表3 各组小鼠血清中ROS和SOD水平比较 （U/mL，x±s）

表4 各组小鼠卵巢组织中SOD活性和MDA含量（x±s）

3 讨论

心理应激是机体受到各种内外环境因素刺激下，通过认识、评价察觉到应激源的威胁而引起的心理、生理机能的非特异性全身反应，包括生活事件、认知因素、心身反应和其他有关因素[8]。旷场试验用于检测小鼠的自发活动和探索欲望，不动时间反映了小鼠的自主活动程度，进入中央区域的次数、中央区域活动时间反映了小鼠的探索欲望[9-10]。已有研究表明，抑郁症大鼠会发生行为学改变，行为学评价和旷场试验可作为判断抑郁症大鼠造模成功的指标[11]。本实验在不同程度慢性不可预知的刺激下，小鼠的体质量呈缓慢增长趋势，而当进入一种新环境，与刺激前比较小鼠表现出不动状态的时间延长，进入中央区域的次数减少，中央区域活动时间缩短，中央区域滞留时间延长的行为学改变，与现有研究结果[9]一致，证实了心理应激能够降低小鼠的自主活动欲望和探索欲望。

在正常情况下，机体内存在一定量的ROS，以保证细胞的生长、激素的分泌等生理过程得以顺利进行，并控制着多种信号转导通路，包括卵泡的生成、卵母细胞的成熟、排卵、黄体形成等过程[12]。机体受到各种内外的刺激等应激源，会产生过量的ROS，过量的ROS引发机体内氧化应激，而氧化应激在女性生殖过程中起着关键作用[13]。评估小鼠卵巢氧化应激反应的主要指标主要为3种抗氧化物酶SOD2、CAT、GSH-Px的表达水平，抗氧化物酶是清除氧自由基的重要物质，表达水平越高其活性越高，机体对抗氧化应激反应的能力越强。本研究结果显示，心理应激可导致小鼠机体内ROS升高，机体ROS清除能力下降，进而可引发机体氧化应激反应，降低机体内SOD的含量。小鼠卵巢内3种抗氧化物酶活性随心理应激刺激程度增加而降低，其氧化应激水平逐渐升高。有研究表明，氧化应激发生时，卵巢组织形态学结构严重损伤，不仅严重影响卵泡发育形态，还会干扰卵母细胞生长及发育质量[14]。因此，心理应激导致ROS的累积，引发氧化应激，从而影响女性的生殖功能。