香烟烟雾对小鼠视网膜组织病理学结构的影响△

罗阿丽 李娟 年申

吸烟会对身体多个器官造成不同程度的影响，是引起老年人死亡的重要原因之一[1-2]，也被认为是造成阿尔茨海默病、认知障碍等疾病的主要危险因素之一[3-4]。有文献报道，吸烟与许多眼部疾病密切相关，其主要是通过缺血或氧化机制影响眼部血液供应[5]。吸烟还可引起氧化应激反应，香烟烟雾中含有产生自由基的氧化剂，自由基会造成细胞损伤、细胞凋亡甚至细胞死亡[6]。虽有文献报道[7-8]香烟烟雾和慢性尼古丁毒性可引起人视网膜神经纤维层、视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)层的一系列变化，对神经节细胞层、内网状层没有明确影响[9]，但是香烟烟雾对人及小鼠视网膜组织病理学结构的影响鲜有报道。本文旨在探讨小鼠在香烟烟雾暴露后视网膜各层组织病理学结构的改变，尤其RPE细胞超微结构改变及其与细胞凋亡之间的关系，为临床防治相关视网膜疾病提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物选取 12 只C57BL雄性小鼠(5～6周龄，体质量18～22 g；由西安交通大学医学院实验动物中心提供)，均为无特定病原体级(SPF级)实验动物。使用裂隙灯显微镜及眼底镜检查小鼠眼前节、眼底未见异常。整个实验中12只小鼠均置于标准环境饲养[10-11]：室温25 ℃±1 ℃，湿度60%±10%，以及交替的12 h明暗周期(早上8点到晚上8点)。所有小鼠均给予相同的水量和食物。本研究所涉及的全部研究方法均遵循《赫尔辛基宣言》，并符合视觉与眼科协会对于实验动物使用的规定，同时获得了西安交通大学医学院动物伦理委员会的批准。

1.2 实验材料Marlboro香烟(万宝路，美国)，模拟人体呼吸系统吸烟的仿生装置(专利201721438419.0)，静式染毒柜(天津合普)，光学显微镜(Olympus BX41，日本)，透射电子显微镜(Hitachi HT7800，日本)，激光共聚焦显微镜(Thermo CellInsight CX5，美国)，石蜡切片机(Leica RM2235，德国)，图像分析系统(Leica Q550CW，德国)，抗三级β-微管蛋白(class III β-tubulin，Tuj1)抗体(11000，Abcam，英国)，山羊抗鼠IgG(1500，Abcam，英国)，TUNEL 染色试剂盒(中国，凯基生物)，苏木素(Sigma，美国)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组12 只小鼠随机分为两组，其中对照组(6只)不做特殊处理，实验组(6只)进行香烟烟雾干预。

1.3.2 动物模型建立实验组小鼠建立动物模型，具体方法为：待小鼠8周龄后开始进行香烟烟雾暴露染毒实验。依照成年吸烟者(体质量70 kg)每天20支的吸烟量设计，按体表面积换算小鼠每天消耗香烟为8支。将小鼠置于静式染毒柜内，通过专利装置(专利号：ZL201721438419.0)，将香烟烟雾传送至染毒柜，每天2次，每次30 min，持续暴露12周。

1.3.3 小鼠视网膜结构观察干预12周后，两组小鼠均给予100 g·L-1水合氯醛腹腔注射麻醉后，摘取双眼眼球，将左眼球分别固定于40 g·L-1多聚甲醛溶液内，依次经体积分数80%(1 min×2次)、95%(3 min×2次)、100%(5 min×2次)乙醇脱水，浸蜡，石蜡包埋，常规石蜡切片，切片厚4 μm。部分切片行HE染色，于光学显微镜下观察视网膜各层组织病理学结构的变化，选取经过视盘的切片，测量视网膜中央部全层、视网膜神经纤维层及内网状层厚度，其余石蜡切片分别用于Tuj1免疫荧光染色及TUNEL凋亡染色。

1.3.4 视网膜Tuj1免疫荧光染色将各组石蜡切片脱蜡后，蛋白酶K工作液(使用PBS稀释至20 mg·L-1)通透15 min，免疫荧光封闭液封闭60 min，Tuj1一抗4 ℃孵育过夜，羊抗小鼠二抗室温避光孵育1 h，含DAPI的封闭液封片，激光共聚焦显微镜下观察拍照。

1.3.5 视网膜 TUNEL染色将各组石蜡切片脱蜡后，蛋白酶K工作液通透20 min，体积分数3%H2O2封闭15 min，TdT 酶反应液孵育60 min(避光)，Streptavidin-Fluorescein工作液避光反应30 min，DAPI染色液复染细胞核后封片，激光共聚焦显微镜下观察拍照。

1.3.6 视网膜RPE细胞超微结构观察参照文献[12]方法进行，将两组小鼠右眼球标本分别置于体积分数2.5%戊二醛前固定2～4 h，10 g·L-1锇酸固定1～2 h；梯度乙醇脱水、环氧树脂浸透、修块，枸橼酸铅和醋酸双氧铀双染，透射电子显微镜下观察RPE细胞的超微结构改变。

1.3.7 图像采集及定量分析分别随机选取各组HE染色切片5张，采用细胞图像分析系统测量每张切片视网膜中央部全层、视网膜神经纤维层、内网状层的厚度，并计数视网膜神经节细胞层细胞数，均取平均值记录。

1.4 统计学方法使用SPSS 17.0统计学软件处理数据，两组间结果数据以均数±标准差表示，采用单因素方差(one-way ANOVA)分析对比组间的差异。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 小鼠视网膜结构观察对照组小鼠视网膜各层结构完整，厚度为(216.53±7.43)μm，内界膜完整、清晰；视网膜神经纤维层内神经纤维结构存在、排列极向较好，厚度为(11.49±0.56)μm；视网膜神经节细胞层内细胞数为(389.72±4.56)个，视网膜神经节细胞的细胞核呈卵圆形，在中央部排列成假复层，周边部呈单层排列，较密集，可见多个毛细血管(图1A)；内网状层结构良好，厚度为(52.08±3.17)μm；内核层细胞核排列整齐，有5～6层；外网状层、外核层细胞核形状规则、排列较紧密，有一定的极向性，外界膜、视锥视杆细胞层均结构良好，RPE层细胞呈矮立方状单层排列，细胞浆内含色素(图1A)。实验组小鼠视网膜厚度为(182.27±4.98)μm，较对照组明显变薄，差异有统计学意义(P<0.05)；内界膜尚完整，部分不清晰；视网膜神经纤维层神经纤维部分变性、消失(图1B)，排列无极向，厚度为(4.62±1.07)μm，较对照组明显变薄，差异有统计学意义学意义(P<0.05)；视网膜神经节细胞层内细胞数为(378.71±2.16)个，与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)；视网膜神经节细胞的细胞核呈卵圆形、部分形状不规则，呈单层排列，排列疏密不均，局部可见细胞核缺失(图1C)，可见毛细血管；内网状层结构良好，厚度为(37.28±2.86)μm，较对照组明显变薄，差异有统计学意义(P<0.05)；内核层细胞核排列较整齐，外网状层、外核层、外界膜、视锥视杆细胞层、RPE层均未见明显异常(图1D)。

图1 两组小鼠视网膜光学显微镜下观察(HE染色)。A：对照组小鼠视网膜神经节细胞层排列整齐，可见毛细血管()，内核层细胞核排列整齐，有5～6层(▲)；B、C：实验组小鼠视网膜神经节细胞的细胞核部分形状不规则，排列较松散，局部可见细胞核缺失()，内核层细胞核排列较整齐(▲)；D：为图C红色方框区域放大图，实验组RPE层细胞核可见，形态规则()

2.2 小鼠视网膜Tuj1免疫荧光染色结果对照组小鼠视网膜神经节细胞排列整齐、密集，大小较一致，细胞浆内及视网膜神经纤维层内可见强的红色免疫荧光信号，内网状层也可见红色免疫荧光信号；实验组神经节细胞排列疏密不均，局灶较松散，细胞浆内可见较强的红色免疫荧光信号，视网膜神经纤维层内红色信号不明显，内网状层也可见红色免疫荧光信号(图2)。

图2 两组小鼠视网膜激光共聚焦显微镜下观察(Tuj1免疫荧光染色)。A、B：对照组小鼠视网膜神经节细胞排列整齐，可见较强的红色荧光信号在视网膜神经节细胞的细胞浆内及视网膜神经纤维层内表达(▽)；C、D：实验组小鼠视网膜神经节细胞排列疏密不均，局灶可见细胞核缺失，视网膜神经节细胞的细胞浆内见红色荧光信号(▽)

2.3 小鼠视网膜RPE细胞超微结构改变RPE细胞位于Bruch膜上。对照组RPE细胞内可见黑色素颗粒，线粒体丰富，形态规则，细胞基底部可见多量质膜褶皱，分布较均匀(图3A)；实验组RPE细胞内线粒体数量稍减少，形态各异，细胞基底部质膜褶皱数量明显减少、局部有缺失(图3B)。

图3 两组小鼠视网膜RPE细胞超微结构。A：对照组RPE细胞位于Bruch膜()之上，细胞基底部可见多量质膜褶皱()；B：实验组RPE细胞基底部质膜褶皱数量明显减少、局部有缺失()(示Bruch膜)

2.4 小鼠视网膜 TUNEL 染色结果对照组及实验组小鼠视网膜各层均未见明显绿色免疫荧光信号表达(图4)。

图4 两组小鼠视网膜TUNEL染色结果。A：对照组；B：实验组

3 讨论

香烟烟雾是由4700种化学成分产生的一种强氧化剂[13]，吸烟是导致世界上老年人死亡的重要原因之一[1-2]，同时吸烟与许多眼部疾病密切相关，它可能大大降低视功能，甚至导致失明[9]。在成年人中，吸烟与年龄相关性黄斑变性和息肉状脉络膜血管病变的风险增加有关，与视网膜和脉络膜厚度减少有关。吸烟是葡萄膜炎的一个重要危险因素。在儿童中，孕期吸烟是引起早产儿视网膜病变的重要危险因素，同时增加了体质量超过2500 g新生儿发生视神经发育不全的风险，且与视网膜神经纤维层变薄有关[14-15]。

视网膜呈透明、薄膜状，从内向外分为 10层，分别是内界膜、视网膜神经纤维层、视网膜神经节细胞层、内网状层、内核层、外网状层、外核层、外界膜、视锥视杆细胞层及RPE层。文献报道[9，16-18]，吸烟者视网膜神经纤维层较薄，慢性重度吸烟者变薄更明显，而神经节细胞层和内网状层没有受到影响。本研究结果证实了香烟烟雾暴露后小鼠视网膜神经纤维层厚度明显变薄，而视网膜神经节细胞层内细胞数量变化不明显，这与以往报道结果[16]相一致。由于个体间视网膜神经节细胞的数量存在很大差异[7]，我们观察到的实验组和对照组间视网膜神经节细胞的排列变化是由于个体间的差异造成的，还是由于香烟烟雾暴露导致的，仍需要进一步探讨。

在本实验中我们还观察到了内网状层厚度的变化，与以往报道不符[16]。虽然内网状层厚度的变化可在一定程度上反映视网膜神经节细胞数量的真实变化情况[19]，但是内网状层也不单是由视网膜神经节细胞的树突组成，我们也在内网状层观察到了移位的无长突细胞，这与以往的报道一致[19]。虽然在我们的实验中没有观察到视网膜神经节细胞数目的明显变化，也没有观察到明确的细胞凋亡发生，但是我们在形态学上观察到了由视网膜神经节细胞轴突构成的视网膜神经纤维层的变化以及Tuj1标记的由视网膜神经节细胞树突组成的内网状层的变化。香烟烟雾对视网膜神经节细胞的数量虽然没有影响，但也许对视网膜神经节细胞的轴突及树突有一定的影响。由于本实验中香烟烟雾仅影响了小鼠12周，我们没有观察到较为明显的细胞凋亡等变化是否与小鼠暴露于香烟烟雾时间较短有关还未可知，仍有待进一步研究。

本研究实验组小鼠的内核层、外网状层、外核层、外界膜、视锥视杆细胞层都未观察到明显变化。RPE层由单层排列的矮柱状上皮细胞组成，起一定的屏障作用。RPE细胞基底部紧附于玻璃膜上，玻璃膜外便为丰富的脉络膜毛细血管。RPE细胞由于具有一定的抗氧化能力，对维持视网膜微环境及保护视网膜中神经元起到了一定的作用。香烟烟雾内的化学氧化剂通过小鼠吸入后入血，然后作用于视网膜，RPE细胞似乎是香烟烟雾作用于视网膜的一个特定目标[20]。文献报道[21-22]，慢性香烟烟雾暴露后RPE细胞受损，在超微结构中可表现出细胞基底部质膜褶皱的减少、缺失，部分细胞的细胞浆内出现空泡，出现地图样萎缩甚至细胞凋亡。除了RPE细胞的超微结构发生改变以外，也有文献报道[22]，慢性香烟烟雾暴露后Bruch膜上有沉积物，并且Bruch膜厚度增加，但是香烟烟雾对RPE细胞的影响要远远大于对Bruch膜的影响。另有文献报道[23-24]，慢性香烟烟雾作用于小鼠后，RPE细胞线粒体膜结构破坏，线粒体嵴局部或全部破坏，受损线粒体靠近RPE细胞基底的外膜肿胀内陷。本研究我们观察到了香烟烟雾暴露小鼠RPE细胞基底部质膜皱褶减少，局部缺失，与上述文献报道结果基本一致，但是我们没有观察到线粒体的变化及细胞凋亡的发生。由于RPE细胞具有显著的抗氧化能力，长期接触香烟烟雾中的氧化剂可能是导致RPE细胞损伤和凋亡的必要条件[25]，所以我们推测本实验中RPE细胞没有观察到明确的线粒体变化和细胞凋亡可能与小鼠接触香烟烟雾的时间不够长有关。

总之，香烟烟雾暴露后小鼠视网膜的组织病理学及RPE细胞在超微结构上发生了一系列的变化，但这些变化是由香烟烟雾中的哪些成分引起的，具体的作用机制是什么等，均有待进一步的研究和探讨。