典型黑土环境下的高、低镉积累白菜品种筛选及耐性比较

陈 辰，朱园辰，喇乐鹏，张思佳，丁工尧，闫 雷

（东北农业大学资源与环境学院，哈尔滨 150030）

近年来，由于设施农业的不合理开展以及工业化程度的逐步加深[1]，致使农业土壤镉（Cd）污染问题日趋严重，许多农用地无法安全利用[2]。据全国土壤污染调查公报显示[3]，我国土壤中Cd的点位超标率为7.0%，农田Cd污染面积高达2×104hm2，已被确定为全国土壤污染首要污染物，而国务院颁布《土壤污染防治行动计划》中要求：到2020年，我国污染地块安全利用率需达到90%以上，因此Cd污染区农用土壤的安全利用已迫在眉睫[4]。Cd在农业环境中具有极高的生物累积性、毒性、环境移动性及持久性。因而极易危害土壤-植物系统，继而威胁食品安全及人类健康。据不完全统计，我国每年生产的Cd含量超标的农产品达“1.46×106t，且呈逐年增长趋势[5]。

有研究表明，因地制宜地开展农作物高、低积累品种筛选可使轻度Cd污染农用地得到安全有效的利用，如污灌区小麦品种筛选[6]及高Cd积累水稻品种筛选[7]等，现均已证实其应用可行性。高、低积累作物品种的筛选工作我国早有开展[8]，受试品种应具备优秀环境适应能力和稳定传代的积累特征[9]。叶菜类蔬菜种类多样，品种丰富，在我国广泛栽培。目前已知不同种类、不同品种叶菜类蔬菜对重金属胁迫存在明显不同的抗性和积累，如大白菜[10]、青菜[11]和菠菜[12]等蔬菜对重金属的吸收与积累存在物种、品种和同一作物不同器官间的显著差异，而普遍的叶菜类蔬菜特别是白菜（Brassica pekinensis L.）品种更易吸收Cd并受其影响[12]。因此，Cd耐受力强，明确积累能力的白菜品种更应适宜在轻度污染的中国北方推广。然而，黑土中较高的有机质和pH虽然能够限制Cd在环境中的迁移能力，但局域性积累却已然威胁到了食品安全[13]。由于黑土的这一特点，Cd在其中的威胁性常受忽视，目前尚缺乏针对北方典型黑土Cd污染环境中高、低Cd积累叶菜类蔬菜的研究。故本研究通过盆栽试验模拟典型黑土区温室栽培条件，针对20种东北地区主栽白菜品种的Cd耐受力及积累特征进行筛选。以期为轻度Cd污染农用地的安全利用及黑土资源保护提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试土壤类型系典型黑土，于2018年5月取自东北农业大学向阳实验基地试验温室区（44°04'N，125°42'E）0～20 cm耕层，过2 mm筛除去砾石等杂质，装袋、烘干、杀菌备用。同时取少量土壤用于土壤常规分析[14]及Cd含量测定[15]，其土壤理化性质见表1。

1.2 试验设计

本试验于2018年5—8月在东北农业大学向阳实验基地温室区10号大棚内进行。为保证各处理间养分含量相同且满足植物生长需要，预先向供试土壤施入尿素、磷酸氢钙和氯化钾作为底肥（N：100 mg·kg-1、P：120 mg·kg-1、K：350 mg·kg-1），使各处理养分水平一致。供试土壤装于聚乙烯塑料盆（20 cm×15 cm×5 cm），每盆装土1.5 kg。共设7组Cd处理：0、0.05、0.1、0.15、0.3、0.6、1.2 mg·kg-1，向土壤中喷施外源Cd溶液（CdCl2·2.5H2O），待其风干后摊开混匀以加速其均质化进程，均质期40 d，期满后播种。供试品种信息见表2。

将供试白菜种子用10%H2O2消毒15 min，后用去离子水冲净，挑选籽粒饱满的种子播种，每盆播种20粒，待植株长至3片真叶时，间苗至每盆6株，期间将土壤含水量保持在田间持水量的65%～70%，及时去除虫害、杂草（整个栽培过程仿照当地习惯栽培模式进行）。每品种、每处理均重复3次，种植30 d后取每品种、每处理长势一致的3株用于Cd剂量-效应分析，40 d后收获余下植株进行Cd积累量及氧化损伤等指标测定，收获时先用自来水将完整的白菜植株冲洗干净，再用EDTA-2Na浸泡植株根系30 min，以去除根系表面有效态Cd，并经去离子水冲洗后用吸水纸擦干，将白菜分为根和可食用部分（叶）分置于-80°C冰箱保存。

1.3 指标测定

收获的白菜样品清理完毕后直接称质量，生物量以鲜质量计。土壤样品处置及Cd含量测定参照《土壤质量铅、镉的测定石墨炉原子吸收分光光度法》（GB/T 17141—1997）[15]，植物根际土壤样品以抖落法收集500 g，四分法缩分至100 g风干，过2 mm筛除去砾石等杂质，研磨使其全部通过0.15 mm筛备用，其中5 g用于水分含量f的测定，另取待测土样0.2 g采用湿式消解法处理，利用石墨炉原子吸收分光光度计（Persee General，TAS-GF 990 super，中国）测定 Cd 含量WCd，其中 f及 WCd按下式计算：

表1 供试土壤理化性质Table 1 Physical and chemical properties of the tested soil

表2 供试白菜编号、品种及原产地Table 2 The code，cultivar and origin of the tested cabbages

式中：f为土壤水分含量，%；W1为烘干前土壤质量，g；W2为烘干后土壤质量，g；WCd为土壤Cd含量，mg·kg-1；c为试液吸光度减去空白试验的吸光度，然后在校准曲线上查得Cd的含量，μg·L-1；V为试液定容体积，mL；m为称取试样质量，g。

植物样品Cd含量测定参照《食品安全国家标准食品中镉的测定》（GB 5009.15—2014）[16]，植物各部分样品称质量后冷冻研磨，取0.50 g经湿式消解法处理，消解完成用1%HNO3定容至25 mL容量瓶中并做试剂空白，试液经12 000 r·min-1离心10 min后取20 μL上清液于石墨炉原子吸收分光光度计进行测定，同时以国家标准物质（GSB 04-1721—2004 188038-4，GBW 08502）进行分析质量控制，所有植物样品Cd回收率均大于95%。按下列公式计算白菜可食用部分（叶）及根中Cd含量W、植株相对生物量RFBs、可食用部分（叶）富集系数BCFs、迁移系数TFs及全株净化率ERs：

式中：W为植物样品Cd含量，mg·kg-1；c1为试样消化液Cd含量，ng·mL-1；c0为空白液 Cd含量，ng·mL-1；V为消化液定容总体积，mL；m为称取试样质量，g；bT为处理组生物量，g；bCK为对照组生物量，g；WLeaf为可食用部分 Cd 含量，mg·kg-1；WRoot为根部 Cd含量，mg·kg-1；b1为可食用部分鲜质量，g；b2为根部鲜质量，g；ms为根际土壤总质量，g。

白菜叶中的氧化损伤通过单位叶片鲜质量的过氧化氢（H2O2）、超氧阴离子（O-2）、丙二醛（MDA）、游离脯氨酸（FPRO）含量来评估，均需取0.5 g新鲜、清洁的叶片样品，在冷冻条件下制备成匀浆待测。过氧化氢含量测定采用硫酸钛-可见分光光度法[17]，超氧阴离子含量测定采用盐酸羟胺-可见分光光度法[18]，丙二醛含量测定采用硫代巴比妥酸（TBA）-可见分光光度法[19]，游离脯氨酸含量测定采用酸性茚三酮-可见分光光度法[20]。

1.4 数据处理及分析

1.4.1 白菜品种Cd剂量效应分析

有研究表明[21]，逻辑斯蒂分布模型（Log-logistic distribution）可较好地拟合重金属对植物的剂量-效应关系，由此推知诸如植物的半数有效量（ED50）等剂量参数，且适用于单一物种的生物敏感性分布（Species sensitivity distributions，SSD），故本研究采用其对不同品种白菜镉胁迫剂量-效应曲线进行拟合，并对拟合结果进行外推，以评估供试白菜品种的Cd耐受力。Log-logistic模型如下：

式中：y为各Cd处理水平白菜相对生物量，%；a、k为拟合参数；x为各个Cd处理的浓度值，mg·kg-1；xc为EC50的自然对数值。

1.4.2 数据处理

采用Excel 2016进行数据处理，Origin 2018软件进行绘图，应用SPSS23.0统计分析软件对数据进行单因素方差分析（One-way ANOVA）和P＜0.05水平下的LSD检验、Tamhane检验。

2 结果与讨论

2.1 不同品种白菜Cd胁迫剂量-效应

图1 不同品种白菜Cd胁迫-剂量效应曲线Figure 1 Dose-effect curves of different cabbage cultivars under Cd stress

不同品种会因Cd剂量不同而产生生物效应上的差异。就白菜而言最直观的剂量-效应便是生物量的变化。如图1，低Cd浓度下（0.05 mg·kg-1），除品种4、6、11、12、16、17、20外的13种白菜生长均表现出一定毒性刺激（Hormesis）效应，较对照生物量增幅0.57%～4.51%，这与Sidhu等[22]研究中发现低浓度Cd促使臭荠（Coronopus didymus L.）生物量增加的情况相似，这或许是植物在低Cd胁迫时的一种保护性“稀释”机制；而随浓度上升，各品种相对生物量均开始降低，此时Cd的毒性抑制对白菜生长产生影响；而土壤Cd浓度达到最大（1.2 mg·kg-1）时，Cd生物量抑制作用最明显。通过剂量效应曲线，可求算出供试白菜Cd的EC50及其95%置信区间，如表3。Cd胁迫下20种白菜EC50的变化范围为 0.469～1.204 mg·kg-1，且 r2最低为0.983，优于Wang等[23]以印度芥菜亚细胞积累表征的研究结果。其中品种18（JF）EC50值最高，为1.204 mg·kg-1；品种20（QT）EC50值最低，为 0.469 mg·kg-1，二者相差2.57倍。

由于盆栽试验环境较为恒定，可排除多数干扰因素，如pH、盐效应等的干扰，因此可通过Log-logistic模型拟合白菜品种生物量，衡量不同品种Cd耐受能力[24]。基于不同品种白菜生物量进行拟合的半数抑制浓度结果可知，黑土栽培过程中供试白菜Cd耐受能力 由 高到 低 依 次 为：JF、BCCRQJ、XF、HX65、XFQB、DHF65、586LSKF2、JYKC、SK、JYKC4、ZB61、FGKC、DN909、CRDW3、JQFSS、JBC、GLDB、DC18J、FGC80F1、QT，品种Cd耐性差异明显，将半数抑制浓度进行对数变换后，继续采用Log-logistic模型对其进行物种敏感性分析（SSD），分布曲线如图2，基于半数抑制浓度的拟合结果较好，r2=0.982 1，大部分品种的实际值大于或接近预测值，但耐性最佳品种JF和最差品种QT有较高预测值，这同Ding等[25]在白菜-土壤系统上建立SSD以评价土壤Cd阈值的结果类似，或许说明其可能在其他环境下具备较高耐Cd潜力。

表3 白菜Cd半抑制毒性阈值浓度（EC50，mg·kg-1）及其95%置信区间Table 3 Toxicity thresholdsof Cd to cabbage cultivars（EC50，mg·kg-1）and their 95%confidence intervals

2.2 不同白菜品种的Cd积累特征分析

图2 不同白菜品种基于半数抑制浓度的物种敏感性分布曲线Figure 2 Cumulative frequencies of species sensitivity distributions（SSD）of thedifferent cabbagecultivarsbased on EC50

土壤中Cd污染程度不同会造成白菜的积累差异，而白菜可食部分（叶）中的Cd积累是评定其食用安全性的重要参数[10]。不同程度Cd污染土壤中供试品种叶积累量分布如图3，对于同一程度Cd污染，20种白菜品种叶中Cd积累量符合正态分布，品种间差异明显，按Cd积累量离散程度由小到大分别为0.1、0.05、0.15、0.3、0.6、1.2 mg·kg-1，其中 Cd投加浓度为0.6 mg·kg-1和1.2 mg·kg-1的土壤中有过半数的供试品种超过或接近《食品安全国家标准食品中污染物限量》（GB 2762—2017）中叶菜类农产品Cd检出限0.2 mg·kg-1[26]，而其他投加浓度下叶Cd积累量较小，难以作为特征积累品种的筛选依据，且0.6 mg·kg-1和1.2 mg·kg-1的土壤Cd添加浓度为《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准（试行）》（GB 15618—2018）中[27]推荐农用地土壤Cd污染风险筛选值（0.6 mg·kg-1，pH＞7.5）的1倍和2倍，可供指导实际筛选工作。因此，为准确切合东北典型黑土耕作环境，筛选出安全可靠的白菜品种，本试验确定以土壤Cd投加浓度0.6 mg·kg-1和1.2 mg·kg-1作为筛选浓度，测定供试品种各部位Cd积累量，以鉴定高、低Cd积累白菜品种。

图3 不同程度Cd污染土壤中白菜品种的积累量范围Figure 3 Accumlation range of cabbage cultivars in soil of different Cd level

白菜品种间各部位Cd积累能力也存在差异，而不同部位Cd积累量差异决定了品种独特的积累特征和植物-土壤效应[28]，供试白菜各部分Cd积累量如图4，当土壤外源Cd含量为1.2 mg·kg-1时（图4A），叶Cd积累最高品种为DHF65（品种15），积累量达1.348 mg·kg-1FW；最低为JF（品种18），积累量仅0.106 mg·kg-1FW，也是试验中唯一一种在1.2 mg·kg-1筛选浓度下Cd积累量低于0.2 mg·kg-1FW国家食品安全标准限值的供试品种。根Cd积累最高品种为BCCRQJ（品种13），积累量达3.128 mg·kg-1FW；最低品种为JF（品种18），积累量为0.614 mg·kg-1FW。大部分叶菜类蔬菜叶Cd积累均保持较高水平，这与张泽锦等[29]的研究相似。而当土壤外源Cd含量为0.6 mg·kg-1时（图4B），叶Cd积累从高到低依次为品种1、5、15、7、3、10、2、9、14、6、4、13、12、8、19、16、17、20、11、18，其中30%超出了国家食品安全标准限值。根Cd积累由高到低依次为品种10、5、1、15、7、9、13、8、3、2、14、20、19、6、4、12、18、16、11、17。由于筛选浓度已经接近或降至品种的耐受浓度，同高浓度组相比，一些品种（如FGC80F1）的Cd积累量有了较大变化，相关研究认为[30]这是由于植物根系在Cd积累中起着主控作用。

图4 供试白菜品种不同部位Cd积累量Figure 4 Cd accumulation in different parts of tested cabbage cultivars

植物Cd积累特征可通过富集系数（BCFs）、迁移系数（TFs）来描述，而根际土壤Cd含量和植物净化率可反映植物-土壤体系中的相互作用，有助于选取适当植物控制土壤污染[31]。供试品种根际土壤Cd含量、富集系数、迁移系数、净化率如表4，1.2 mg·kg-1筛选浓度下，品种间根际土壤Cd含量差异明显（P＜0.05），CRDW3（品种1）具有最强的叶Cd富集能力，是最弱品种QT（品种20）的10.8倍，FGC80F1（品种17）根叶间Cd迁移最强，为最弱品种JF（品种18）和QT（品种20）的5.0倍，BCCRQJ（品种13）单株净化能力最佳，是最低品种XFQB（品种19）的11.7倍；0.6 mg·kg-1筛选浓度下的品种间根际土壤Cd含量差异也十分明显（P＜0.05），但品种积累特征并不同于高浓度（1.2 mg·kg-1），BCCRQJ（品种13）叶Cd富集能力最高，是最低品种JF（品种18）的5.7倍，JYKC（品种6）根叶间Cd迁移能力最高，为最低品种JF（品种18）的4.2倍，BCCRQJ（品种13）在0.6 mg·kg-1筛选浓度下也具有最高Cd净化率，为14.28%，最低的QT（品种20）与之相差5.6倍。相关研究认为[32]低积累植物可食用部分迁移系数和富集系数应小于1，且系数越小越说明污染物难向可食用部分积累，而高积累植物迁移系数和富集系数则越大越好，也有学者[33]发现青葙（Celosia argentea Linn.）等Cd超积累植物叶积累能力高于根系。不仅如此高积累植物更看重对污染物的净化率，净化率越高，单株净化能力越强，吴志超[34]也据此完成对高、低Cd积累油菜的筛选。

2.3 高、低Cd积累品种的浓度积累效应

可投入实际生产的高、低Cd积累品种需具备耐受力强，积累特征稳定且显著的特点，而其积累量也与生物量存在联系[35]。由于95%的供试品种在1.2 mg·kg-1筛选下生长不良，仅JF在此浓度下有较高生物量，结合各品种半数抑制浓度（表3），BCCRQJ（品种13）Cd耐受力仅次于JF，且净化率最高，仅根部积累量就达3.128 mg·kg-1FW，可作为高Cd积累品种适用于≤0.6 mg·kg-1Cd污染地区，而JF（品种18）叶Cd积累量低，Cd富集、迁移因子均小于1，0.6 mg·kg-1筛选条件下JF叶仅含Cd 0.031 mg·kg-1FW，可保证食用安全，可作为低Cd积累品种应用于≤0.6 mg·kg-1Cd污染地区。对比二者随土壤外源Cd含量变化的积累能力发现（表5），两品种叶、根的Cd积累量均显著增高（P＜0.05），其中BCCRQJ（品种13）叶、根积累量在1.2 mg·kg-1下最高，分别为JF的4.8倍和5.1倍。而对比二者净化率可发现（表5），土壤外源Cd浓度增加会降低两品种净化效率，但即使在高浓度下（1.2 mg·kg-1），BCCRQJ净化率也高于唐皓等[7]研究中高Cd积累品种的净化率。低浓度下（0.15 mg·kg-1）BCCRQJ净化率有所升高，这可能是由于低浓度Cd刺激了BCCRQJ的吸收与体内输送[36]。不过，虽然BCCRQJ有较高单株净化率，但积累量较低，远不及龙葵[37]等超积累植物的净化能力。

表4 供试白菜品种根际土Cd含量、富集系数、迁移系数及净化率Table 4 Cd content in rhizosphere，bioconcentration factors（BCFs），translocation factors（TFs），and extraction rates（ERs）of tested cabbage cultivars

2.4 Cd胁迫下两种白菜的氧化损伤

Cd胁迫会导致白菜积累过氧化氢、超氧阴离子等活性氧（ROS），造成氧化损伤产生大量丙二醛和游离脯氨酸[35]，且氧化损伤的程度受Cd浓度影响[38]。Cd诱导不同品种白菜产生的氧化应激反应与基因型有关，不同外源Cd浓度下，两白菜品种叶中的过氧化氢、超氧阴离子、丙二醛及游离脯氨酸含量如图5所示。

正常植物体内过氧化氢（H2O2）、超氧阴离子（O-2）等活性氧的产生和清除维持着动态平衡，Cd胁迫会打破该平衡，致使其瞬时积累继而氧化损伤细胞膜结构，其含量是表征植物氧化损伤程度的重要指标，如图5A、图5B。外源Cd含量与两种白菜叶中H2O2含量及O-2含量均呈显著正相关（P＜0.05），但BCCRQJ中H2O2增长率高于JF，而O-2增长率则低于JF：当土壤中Cd浓度达到1.2 mg·kg-1时，BCCRQJ的H2O2含量较对照（0 mg·kg-1）增长了94.2%，而JF增长了38.7%；BCCRQJ的O-2含量较对照增长了200.2%，而JF增长了217.8%。当植物遭受Cd胁迫，O-2的动态平衡会率先被打破，大量O-2的积累会加速细胞衰亡，而H2O2作为植物自身O-2清除反应的中间体，也会大量积累[39]。当低浓度Cd（0.15 mg·kg-1）胁迫JF时，其H2O2含量有所降低，这可能是由于JF自身抗氧化能力提高所致，这同Singh等[40]对于Cd胁迫番茄幼苗的研究结果类似。

表5 不同浓度外源Cd胁迫下两种白菜的Cd积累Table 5 Accumulation of two cabbage cultivars under different exogenous Cd concentrations

图5 不同浓度外源Cd胁迫下两种白菜氧化损伤指标Figure 5 Oxidative damage factors of two cabbage cultivars under different exogenous Cd concentrations

丙二醛是脂质过氧化的重要产物，而游离脯氨酸通常伴随植物盐胁迫而激增，正常状况下含量极低，二者均可作为评价Cd诱导植物产生氧化损伤程度的重要指标[41]，如图5C和图5D。两白菜品种MDA、FPRO含量均随土壤Cd含量升高而显著增高（P＜0.05），同对照相比，1.2 mg·kg-1土壤Cd浓度下，BCCRQJ的MDA含量增长了124.1%，FPRO含量增长了284.9%，JF则分别增长了114.4%和186.4%。Mzoughi等[42]也将MDA作为反映植物Cd诱导氧化损伤程度的指标，发现了Cd胁迫菠菜组织MDA大量积累；同样Ozfidan-Konakci等[43]认为FPRO含量增加可视作胁迫发生标志，观察到Cd处理7 d小麦幼苗中FPRO含量显著升高。另外，当外源Cd增至最高（1.2 mg·kg-1），BCCRQJ中 H2O2、O-2、MDA、及FPRO含量水平均高于JF，除O-2外，BCCRQJ各指标增幅也高于JF，孙园园等[44]对于高Cd积累植物黑麦草的研究中也发现，随Cd含量升高脯氨酸、MDA含量有所上升，细胞质、膜过氧化明显。这意味着在较高的污染水平下高Cd积累白菜品种或许会比低Cd积累白菜品种承受更严重的氧化胁迫。

3 结论

（1）20种白菜对于Cd胁迫的敏感性分布具有显著差异，其中JF具有最强Cd耐性，耐受阈值为1.204 mg·kg-1，BCCRQJ次之，为1.036 mg·kg-1，QT Cd耐性最差，仅为0.469 mg·kg-1。

（2）不同土壤Cd浓度下20种白菜可食用部分积累量差异均明显，其中土壤外源Cd含量为1.2 mg·kg-1时种间差异最大，0.6 mg·kg-1时次之。此两浓度下：JF可食用部分Cd积累量均最低，低于国家食品安全标准限值0.2 mg·kg-1（叶菜类产品）；迁移、富集系数均小于1，说明其可作为在东北地区安全生产的低Cd积累品种。而BCCRQJ净化率最高，为18.64%，说明其有较好Cd吸收作用，为高Cd积累品种，具有一定植物修复潜力。

（3）JF和BCCRQJ叶、根Cd积累量与土壤Cd含量呈显著正相关，净化率与之显著负相关（P＜0.05）。且随Cd胁迫程度加剧，二者氧化损伤越严重，过氧化氢、超氧阴离子、丙二醛、游离脯氨酸含量均随土壤外源Cd含量上升而显著增加（P＜0.05），但BCCRQT除超氧阴离子外的氧化损伤指标增幅均高于JF，说明高Cd积累品种能承受更高的氧化损伤风险，而低积累Cd品种JF能更好地抵抗Cd诱导的氧化胁迫。