响应面法优化乳源蛋白水解工艺

范梦珠，郭婷，林文珍，李文瑾，陈平，洪志骏，张少辉,

（1.上海交通大学农业与生物学院，上海200240；2.浙江熊猫乳业集团股份有限公司，浙江温州325800；3.浙江辉肽生命健康科技有限公司,浙江温州325800）

0引言

蛋白质在人们的营养结构组成中占据重要位置。蛋白在水解后其分子量明显变小，随着蛋白水解程度的增加，其抗原性明显降低[1]。水解度是衡量蛋白水解程度最主要的因素，影响着蛋白水解产物的功能特性如乳化、凝胶、风味等[2-3]。脱脂乳蛋白种类丰富，有研究表明不同蛋白种类的水解产物对健康人的饱腹感和抑制食欲激素的分泌会产生一定的影响[4]。因此，脱脂乳源蛋白水解产物对于代餐等功能性食品的开发有重要价值。

目前，水解蛋白的制备方法主要有酸水解法、碱水解法和酶水解法。酸水解和碱水解都有一定的弊端且不具有专一性[5]。酶水解法的主要优势是水解条件温和、副反应少、不破坏敏感氨基酸和水解产物，在营养、风味、工艺等方面均优于酸、碱水解法[6-7]。因酶具有专一性的特点，而脱脂乳中蛋白种类丰富，因此单纯用酶对脱脂乳蛋白进行水解并不能达到很好的效果。

乳酸菌是一类重要的益生菌，瑞士乳杆菌是乳酸菌中营养缺陷型最高的菌种之一，具有强大的蛋白水解能力，其蛋白水解产物具有抗高血压、提高免疫力、消炎和抗癌等功能[8-11]。本文是采用瑞士乳杆菌与酶结合对乳源蛋白进行水解的方法，以蛋白水解度为指标，并通过响应面法对工艺进行优化，为益生菌水解蛋白粉的工业化生产提供参考。

1材料及方法

1.1材料

MRS培养基，青岛海博生物技术有限公司；脱脂乳，恒天然商贸(上海)有限公司；瑞士乳杆菌CICC6024，北京北纳创联生物技术研究院；复合胰蛋白酶（酶活力2×105 u/g），AB Enzymes公司；酸性蛋白酶（酶活力1×105 u/g），宁夏夏盛实业集团有限公司；胃蛋白酶（酶活力4×105 u/g），默克生命科学（上海）有限公司；氯化钠NaCl，上海凌峰化学试剂有限公司；其余试剂购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2设备

JB-VS-1300U超净工作台，上海屹明净化设备有限公司；SCIENTZ真空冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司；LRH-250F生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；GI36T高压灭菌锅，致微（厦门）仪器有限公司；Froma 700低温冰箱，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；RO 15纯水系统，力康生物医疗科技控股有限公司；GL-22M高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1益生菌水解蛋白粉制备工艺

操作要点如下：（1）菌种活化，取本实验室-80℃低温冰箱中冻存的瑞士乳杆菌CICC6024，置于37℃恒温培养箱中解冻10 min。将解冻后的瑞士乳杆菌接种于灭菌的MRS液体培养基中，接种量5%（v/v），37℃静置培养12 h，此为第一次活化。从活化发酵液中取活化后的菌液再次接种于MRS液体培养基中，接种量2%（v/v），37℃静置培养8 h，此为第二次活化。取二次活化的菌液使用。（2）酶溶液制备方法[12]。分别称取复合胰蛋白酶0.25 g、酸性蛋白酶0.5 g、胃蛋白酶0.125 g溶于10 mL灭菌RO水中，并依次通过0.45 um滤膜、0.22 um滤膜进行过滤除菌，分别得到酶活力为5 000 u/mL的复合胰蛋白酶溶液X,酸性蛋白酶溶液Y、胃蛋白酶溶液Z，现配现用。（3）脱脂乳浓度为12%（w/w），95±1℃巴氏杀菌5～6 min，然后冰水浴快速冷却至42℃以下，然后接种二次活化后的菌液，在接种菌液的同时按比例接种X、Y、Z，37℃恒温培养箱静止发酵一定时间得到发酵液。（4）离心参数为2 500 g、4℃、10 min。（5）真空冷冻干燥条件为温度-68±2℃，时间48 h，真空度2 Pa。

1.3.2蛋白酶种类的筛选及水解度的测定

质量分数为12%（w/w）脱脂乳用0.1 mol／L的NaOH调至p H 7.0，95℃灭菌5min，冰水浴快速冷却后接种二次活化后的瑞士乳杆菌菌液，接种量2%（v/v）。酶制剂的添加方式参考[13]，具体如下：根据蛋白酶的活性在接种菌种的同时分别加相应比例的X、Y、Z蛋白酶溶液，蛋白酶用量60 u/mL，37℃恒温培养箱中发酵24 h，期间每隔2 h取一次样品，进行水解度的检测。水解过程中用0.5 mol／L NaOH中和水解液，用PH-stat法测水解度[14]，水解后的水解液95℃灭酶5 min，水解度计算公式：

水解度DH%=(B×M b)/(α×M p×htot)*100%

式中：B-NaOH体积，mL

M b-NaOH浓度，mol/mL

α-氨基的平均解离度，酪蛋白的1/α为2.26

M p-蛋白质的质量，g

htot-对于酪蛋白，取值为8.2 mmol/g

1.3.3单因素实验

根据试验结果筛选确定复合胰蛋白酶X为最佳蛋白酶后，进行如下单因素实验。

（1）发酵时间的单因素实验，条件为：复合蛋白酶用量60 u/mL、发酵温度37℃，发酵时间分别取0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h对水解度进行测定。

（2）蛋白酶用量的单因素实验，条件为：发酵时间12 h，发酵温度37℃，复合胰蛋白酶用量分别取0、20、40、60、80、100、120、140、160 u/mL对水解度进行测定。

（3）发酵温度的单因素实验，条件为：发酵时间12 h，复合蛋白酶用量60 u/mL、发酵温度分别取31、34、37、40、43℃对水解度进行测定。

1.3.4响应面优化实验

以单因素实验的结果为基础，以水解度为指标，根据Box-Behnken中心设计实验原理进行响应面法优化，选取发酵时间、酶制剂的添加量、发酵温度3个影响因子，分别选取3个水平，采用3因素3水平的响应面曲面分析方法，对水解条件进行优化设计，确定最佳工艺参数。

2结果与分析

2.1蛋白酶的筛选

根据已有的研究结果，酸性蛋白酶和瑞士乳杆菌协同发酵可以显著提高乳源性生物活性肽的产量[12]。复合胰蛋白酶和胃蛋白酶是酶解法降解蛋白，提高蛋白水解度常用的两种蛋白酶[15]。因此，在菌酶协同发酵实验中选择这三种蛋白酶研究发酵时间与不同种类蛋白酶对乳源蛋白水解度的影响，结果如图1所示。

图1不同蛋白酶及酶解时间对蛋白水解度的影响

从结果可以看出，发酵时间在4 h以内，胃蛋白酶、酸性蛋白酶、复合胰蛋白酶和不加酶组对蛋白水解度影响差异不大，在4 h以后复合胰蛋白酶组对蛋白的水解优势明显优于其他三组。原因可能是在发酵初期由于p H的影响，蛋白酶的活性受到抑制，加酶组和不加酶组对蛋白水解度的影响并无较大差异。在4 h后，复合胰蛋白酶的表现出的活性最强，在整个发酵期间对蛋白水解的效果明显优于另外三组，因此选择复合胰蛋白酶用于后续试验。

2.2单因素实验

2.2.1发酵时间对蛋白水解度的影响

由图1可知，发酵初期蛋白水解度基本并无较大差异，发酵时间超4 h后，蛋白水解度开始出现明显增加，12～24 h之间蛋白水解度呈现轻微波动，在16 h处蛋白水解度达到最大值，为71.65±3.08%，统计分析结果表明12 h、16 h处的水解度并无显著性差异（P＞0.05）。分析认为，瑞士乳杆菌是高度营养缺陷型的乳酸菌，自身可以产生丰富的蛋白酶系分解底物，满足自身的生长，从整个协同发酵过程可以看出，瑞士乳杆菌自身表现出强大的蛋白水解能力，外源复合胰蛋白酶起到辅助作用。发酵初期，培养液没有达到瑞士乳杆菌生长的最适p H值，其生长受到抑制，对蛋白水解的程度不高，在4 h后，逐渐进入瑞士乳杆菌的对数期，水解程度开始出现快速增加。达到最大值后水解度出现轻微波动，一方面考虑到底物营养被瑞士乳杆菌吸收利用后逐渐减少，一方面可能是瑞士乳杆菌的代谢产物积累抑制了反应的进行。根据实际的生产情况，考虑到生产效率，确定12 h为最佳发酵时间，此条件蛋白水解度为68.21±2.88%。

2.2.2酶的添加量对蛋白水解度的影响

由图2可知,胰蛋白酶剂量的增加有助于蛋白水解度的提高，最佳复合胰蛋白酶用量为80 u/mL，此条件下的水解度为69.24±3.12%。当复合胰蛋白酶用量小于80 u/mL时，蛋白水解度随着蛋白酶用量的增加而增加；当用量高于80 u/mL时，蛋白水解度反而出现轻微下降，原因可能是随着外源蛋白酶用量增加到一定程度后，一方面出现了酶与底物结合位点的饱和，另一方面外源蛋白酶对瑞士乳杆菌自身产生的酶系产生一定抑制作用，影响了瑞士乳杆菌自身的生理活动，使蛋白水解度下降。

图2胰蛋白酶用量对蛋白水解度的影响

2.2.3发酵温度对蛋白水解度的影响

由图3可知，发酵温度对蛋白水解度影响较大，随着温度的升高，蛋白水解度呈现先上升后下降的趋势。当温度达到37℃，蛋白水解度最高，为71.25±2.12%，这可能是因为37℃是瑞士乳杆菌的最适生长温度，自身产生蛋白酶的能力最强。随着温度升高，自身生长受到抑制导致自身产生的蛋白酶的量减少，加上酶的活性也受到抑制，因此水解度急剧下降。

图3发酵温度对蛋白水解度的影响

由单因素试验结果可知，以脱脂乳源蛋白水解度为指标，复合胰蛋白酶与瑞士乳杆菌协同发酵作用最佳，最佳发酵条件为：发酵时间12 h，复合胰蛋白酶用量80 u/mL，发酵温度37℃。以此实验结果的基础上，进行响应面优化试验。

2.3响应面优化蛋白水解工艺条件

2.3.1响应面实验设计与结果

在单因素实验结果的基础上，采用Box-Behnken中心组合设计原理，以发酵时间（A）、酶用量（B）、发酵温度（C）为自变量，以蛋白水解度为响应值进行响应面试验设计，试验设计及结果见表1，具体分析结果见表2。

表1 Box-Behnken实验设计与结果

由表2可知，此回归方程模型显著性检测P＜0.0001，极显著，表明该回归方程模型具有统计学意义；失拟项P=0.2926＞0.05，差异不显著，表明该模型可以充分解释响应中的变异，未知因素对试验结果影响较小。该模型的确定系数R2=0.9771，调整系数0.9477，说明该模型能解释94.77%响应值的变化，试验误差较小，拟合度较高，可以用此模型对蛋白水解度进行分析和预测。

表2响应面实验模型方差分析

根据回归模型系数显著性检验结果，其中平方项A2、C2均小于0.01，B 2小于0.05，即发酵时间、发酵温度具有极显著的二次效应，酶用量有显著的二次效应。交互项AB小于0.05，交互项AC、BC大于0.05，说明发酵时间和酶用量的交互作用显著，发酵时间和发酵温度、酶用量和发酵温度的交互作用不显著。

采用Design-Expert 11.1.0对试验数据进行多元回归拟合，得到的回归方程如下：

水解度Y=-376.714+22.758A+0.717B+14.282C-0.0269AB-0.108AC+0.00316BC-0.642A2-0.00299B2-0.173C2（1）

2.3.2响应面分析与条件优化

模型（1）的响应面和等高线见图4-图6。

由图4可知，发酵时间固定为12 h时，发酵温度低于37℃，随着酶用量的增加，水解度不断增加，而当发酵温度高于37℃，水解度基本处在一个较为平稳的状态，增加酶用量对于水解度增加的效果不大。随着发酵温度的升高，水解度先增加后减少，当酶用量低于80 u/mL时，水解度的最大值受到一定限制并且最大水解度到来的较迟，当酶用量高于80 u/mL时，水解度达到最大的阶段到来的较早。根据模型分析结果，发酵温度和酶用量交互作用显著。

由图5可知，发酵温度固定为37℃,水解度随着酶用量的增加而呈现先增加后减少的趋势，当酶用量为80 u/mL，水解度达到最大值，当发酵时间小于12 h时，酶用量的增加使水解度增加的效果不是很明显，当发酵时间在12～14 h，水解度达到一个最大的阶段，随着酶用量的增加，水解度增加的幅度较小，基本处在一个较为平稳的状态。根据模型分析结果，发酵时间和酶用量交互作用不显著。

图4蛋白酶用量B和发酵温度C的响应面和等高线图（A=12 h）

图5发酵时间A和蛋白酶用量B的响应和等高线图（c=37℃）

图6发酵时间A和发酵温度C的响应面和等高线图（B=80 u/mL）

由图6可知，当复合胰蛋白酶用量固定为80 u/mL时，随着发酵温度的上升，水解度呈现先上升后下降的趋势，随着发酵时间的延长，水解度也呈现先上升后下降的趋势，当温度低于37℃，下降趋势明显，当温度高于37℃，水解度整体维持在一个较高水平，下降幅度较小。根据模型分析结果，发酵时间和发酵温度的交互作用不显著。

根据模型分析结果，发酵时间、复合胰蛋白酶用量、发酵温度三个因素的影响作用由大到小排列顺序依次为发酵温度＞发酵时间＞酶用量。通过模型优化，得到的最佳水解度的发酵工艺参数为：发酵时间12.88 h，蛋白酶用量83.22 u/mL，发酵温度38.89℃，此条件下理论蛋白水解度为71.44%。

为了检验响应面法优化实验结果的可靠性，采用优化过的条件进行脱脂乳源益生菌水解蛋白的制备的重复实验，考虑到实际情况，对工艺参数进行微调结果为：发酵时间13 h，蛋白酶用量83 u/mL,发酵温度39℃。最终得到的实际蛋白水解度为72.21±2.12%，相对误差为1.07%。因此，响应面法所得的优化条件参数可靠，该模型具有实用价值，可以为工业化益生菌水解蛋白粉的生产提供理论依据。

3结论

本实验采用瑞士乳杆菌与蛋白酶结合的发酵方式，以脱脂乳为原料，以水解度为指标。通过比较不同蛋白酶与瑞士乳杆菌结合对增加脱脂乳源蛋白水解度的效果后，筛选出制备脱脂乳源水解蛋白的最佳蛋白酶为复合胰蛋白酶。

在单因素实验的基础上，根据Box-Bohnken中心组合原理进行响应面优化，得到了蛋白水解度与发酵时间、酶用量和发酵温度的回归模型。研究结果表明：发酵温度和蛋白酶用量的交互作用对蛋白水解度的影响为显著（P＜0.05）。确定的最佳工艺参数为：发酵时间13 h，蛋白酶用量83 u/mL,发酵温度39℃，此条件下蛋白水解度为72.21±2.12%。与原工艺单纯用瑞士乳杆菌发酵相比，水解度提高50.90%。此研究结果为工业化发酵益生菌水解蛋白粉的生产提供了理论依据和指导。