黄芪Astragali Radix与其伪品饮片的分子鉴别

王 伟，原 野，南 蓬

(复旦大学 生命科学学院 生物多样性与生态工程教育部重点实验室，上海 200438)

根据《中华人民共和国药典》规定，中药材黄芪的来源是豆科黄芪属膜荚黄芪(Astragalusmembranaceus)及其原变种蒙古黄芪(Astragalusmembranaceusvar.mongholicus)，用药部位是其干燥根部，是我国最常用的中药材之一[1].黄芪始载于《神农本草经》，传统中医学认为黄芪位列中药上品，生用可固表托疮，密炙黄芪可用于益气补中；现代医学研究表明，黄芪在增强机体免疫力、抗病毒、抗衰老、强心等方面具有重要的医疗价值[2-6].

近年来随着对黄芪的深入研究，其作为重要的药食两用资源被不断开发，市场需求量快速增加，黄芪资源供不应求，不少不法分子趁机将黄芪伪品冒充正品在药材市场售卖.目前，市面上常见的黄芪伪品有: 紫苜蓿(Medicagosativa)，梭果黄芪(Astragalusernestii)，背扁黄芪(Astragaluscomplanatus)，多序岩黄芪(Hedysarumpolybotrys)，白花草木犀(Melilotusalbus)，锦鸡儿(Caraganasinica)，蜀葵(Althaearosea)，大野豌豆(Viciagigantea)等[7-8].黄芪正伪品的疗效相去甚远，正品膜荚黄芪和蒙古黄芪的有效成分主要为毛蕊异黄酮及其糖苷、黄芪甲苷等，并且安全无毒[9].部分伪品可能存在一定的毒性，如在比格犬毒性试验过程中发现，300mg/kg剂量的蜀葵对比格犬生殖系统有一定的影响，且给药组在停药观察期间出现呕吐、恶心反应[10]；有些伪品如锦鸡儿、紫苜蓿不含毛蕊异黄酮及其糖苷、黄芪甲苷这两类主要的有效成分[11-12]，同属中的背扁黄芪与梭果黄芪同样也未检测到这些物质[13-14].因此，确保黄芪药材的准确性、厘清伪品的来源和种类对于黄芪用药的安全性和有效性都十分重要.

市面上流通的中药材几乎都需要经过人为的加工和炮制，黄芪正品与伪品的根部切片在外形、显微特征乃至部分化学成分上都十分相似，如多序岩黄芪和蜀葵的外观接近正品膜荚黄芪，伪品梭果黄芪、背扁黄芪和锦鸡儿的外观与正品蒙古黄芪十分接近.在实际鉴别中难以运用传统形态鉴别办法区分，而DNA条形码技术具有简便、微量、特异性强的特点，为黄芪正品与伪品的鉴别提供了新的方法和思路.

本研究使用ITS、rbcL、psbA-trnH3种通用DNA条形码，对2种黄芪正品膜荚黄芪和蒙古黄芪及6种常见的伪品: 多序岩黄芪、紫苜蓿、锦鸡儿、大野豌豆、背扁黄芪和梭果黄芪进行分子鉴别，旨在探讨DNA条形码在黄芪与其伪品饮片鉴别中的应用，为黄芪正品与伪品的鉴别提供准确有效的标准.

1 材料与方法

1.1 材料

黄芪正品膜荚黄芪、蒙古黄芪与常见伪品梭果黄芪、背扁黄芪、锦鸡儿、多序岩黄芪干燥饮片均采收自甘肃、内蒙、安徽、陕西、河北等各大药材市场，每种饮片选取3个产区的药材(图1)；紫苜蓿、大野豌豆是2017-2018期间从四川、福建等地采集得到的干燥植物样品，每种植物随机选取3个植株，植株间距100m以上，材料基本信息如表1所示，所有样品都经过南京农业大学中药材研究所吴健老师进行形态学鉴定，样品皆保存于复旦大学生命科学学院分子与进化生态学实验室.

表1 黄芪正品与伪品材料信息表Tab.1 Basic information of authentic and counterfeit Huangqi

1.2 方法

1.2.1 植物总DNA的提取、通用引物设计及测序

本研究所有供试材料均为药材炮制后的饮片或者干燥植物，使用天根DP305-03植物DNA提取试剂盒对供试样品的DNA进行提取，依据前人的文献研究[15-17]，选取ITS，rbcL，psbA-trnH3种通用的DNA条形码，相关PCR反应条件如表2所示，PCR扩增得到的产物由上海美吉生物公司进行测序，样品采用双向测序.

表2 PCR扩增选用序列以及对应的反应条件Tab.2 Sequences of used primers and corresponding PCR reaction conditions

1.2.2 序列分析

双向测序获得的序列使用seqman软件拼接，先使用NCBI的BLAST工具进行比对，确认物种信息的准确性(https: ∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，随后使用Mega6.0软件进行序列比对，并基于p-distance模型计算种间及种内遗传距离以绘制遗传距离图检验各基因的Barcoding gap.采用DAMBE软件进行核苷酸替换饱和性分析[18-19]，使用MEGA 6.0软件以分支自展值bootstrap作1000次可信度分析(bootstrap值用来检验聚类树分支可信度，根据所选的模型将序列位点进行重排构树，出现相同的分支会为该分支增加一分，一般认为分支自展值≥70%的情况下，聚类树的结果较为可靠.本研究中为了直观展示聚类树分支自展值的大小，用三角形表示分支自展值≥70%的情况)，构建NJ树(Neighbor Joining Method，邻接法)，根据建树结果考察单一DNA条形码及组合DNA条形码对黄芪正、伪品鉴别的能力.

2 结果与分析

2.1 通用DNA条形码序列结果分析

所有供试样品DNA通用条形码的序列特征如表3所示.在3种DNA通用条形码中，psbA-trnH序列经比对后的变异位点数及信息位点数为160个；ITS序列变异位点数及信息位点数最多，分别为196个；rbcL序列的变异位点数及信息位点数最少，共有57个.

表3 供试样品序列特征Tab.3 Sequence analysis on single barcode

2.2 DNA Barcoding gap检验

使用MEGA 6.0软件基于p-distance模型计算所有供试样品的种内、种间遗传距离，遗传距离是指以任何对象(序列、基因次序、基因有无、蛋白质结构等)采用各种方法估计的两个OTU(个体、群体、物种、种上分类单元或基因家族序列)之间的差异值，相同的OTU之间的距离为0，不同的OTU之间的距离大小与其相似程度成反比，遗传距离可以直观地体现序列之间的差异程度[20].本研究中各物种基于p-distance模型计算所得的遗传距离如图2显示，颜色越浅代表遗传距离越小，颜色越深代表遗传距离越大.

随后利用Microsoft Office Excel绘制遗传距离图，根据计算结果如图3显示: 3种DNA条形码的平均种内遗传距离较为稳定，全部集中于0～0.002的区域内，rbcL平均种内遗传距离为0，平均种间遗传距离为0.0360，种间遗传距离最大的是大野豌豆与多序岩黄芪.

ITS序列平均种内遗传距离为0.0001，平均种间遗传距离为0.1110，种内遗传距离最大的是蒙古黄芪，种间遗传距离最大的是紫苜蓿与背扁黄芪.

psbA-trnH序列平均种内遗传距离为0，平均种间遗传距离为0.1261，种间遗传距离最大的是大野豌豆与多序岩黄芪.由以上结果可知，本研究所选用的3种DNA条形码种间变异度大，种内变异小且稳定，存在较为明显的DNA Barcoding gap.

2.3 单一DNA条形码构建聚类树

选取ITS、rbcL、psbA-trnH片段保守区域，并使用DAMBE软件进行核酸替换饱和性检验，随后基于得到的DNA条形码序列构建NJ聚类树以考察单一DNA条形码鉴别黄芪与其伪品的能力.

NJ树结果表明，单一DNA条形码在不同属间的黄芪正、伪品鉴别中的正确率较高，在属下种间的物种鉴别中的效果一般.rbcL、ITS、psbA-trnH序列可以将不同属间的黄芪正品与伪品区分开，但是，rbcL片段无法区分膜荚黄芪、蒙古黄芪和伪品梭果黄芪.

与rbcL片段类似，ITS可将黄芪属与其他属的样品区分开，但其同样无法区分膜荚黄芪、蒙古黄芪和伪品梭果黄芪，并且ITS部分分支支持率较低.

psbA-trnH片段NJ聚类树结果表明，该片段也可区分不同属间的黄芪正品与伪品，但在黄芪属内的伪品鉴别效果一般.以上结果证明，使用单一DNA条形码很难将所有黄芪正品与伪品区分开.

2.4 组合DNA条形码构建聚类树

综合3种单一DNA条形码rbcL、ITS、psbA-trnH的NJ聚类树发现，单一DNA条形码在黄芪属内正品、伪品中的鉴别效果不佳.因此，采用组合DNA条形码形式提高分辨力.在前人研究基础上，本研究分别采用了rbcL+ITS[21]，rbcL+psbA-trnH[22]，rbcL+ITS+psbA-trnH[23]，ITS+psbA-trnH[24]4种条形码组合评估其在黄芪正品与伪品中的鉴别能力.

综合4种组合条形码的NJ聚类树(图5)结果发现，ITS+psbA-trnH，rbcL+psbA-trnH及rbcL+ITS+psbA-trnH这3种组合DNA条形码在黄芪与其伪品鉴别中的效果较好(图5(a),(c),(d)).

rbcL+ITS组合条形码在同属间的物种鉴别效率一般(图5(b))，该组合无法区分黄芪属内的正品与伪品，且该组合条形码分支支持率低于50%，可信度不高.

ITS+psbA-trnH组合条形码构建的NJ聚类树(图5(a))支持率明显高于rbcL+ITS组合，该组合条形码在不同属间的物种鉴别成功率尚可，且在黄芪属内的伪品鉴别中，该组合可将2种正品膜荚黄芪、蒙古黄芪与2种伪品梭果黄芪、背扁黄芪厘清，表明该组合条形码鉴别效果尚可.

rbcL+psbA-trnH组合条形码在黄芪正伪品鉴别中分辨率良好(图5(c))，使用该组合条形码，也可将正品黄芪与其余伪品区分开，且各物种内各自形成单系分支，说明使用该组合条形码可以将本研究中所有供试样品全部区分开.

与rbcL+psbA-trnH及组合条形码ITS+psbA-trnH类似，使用rbcL+ITS+psbA-trnH组合条形码联合构树也可将全部供试正品、伪品区分开(图5(d))，且这3种组合条形码聚类树的分支支持率皆较高，结果较为可信.

综上，使用rbcL+ITS+psbA-trnH，rbcL+psbA-trnH及ITS+psbA-trnH3种条形码组合均可将本研究中的2种黄芪正品，6种伪品全部区分开来，表明这3种组合条形码可作为黄芪与其伪品鉴别的有效手段.

3 讨 论

黄芪药材正品、伪品的鉴别问题一直备受关注，相关研究表明: 利用紫外光谱、石蜡切片可以鉴别膜荚黄芪与紫苜蓿[25]；皂苷实验、生物碱实验及纸层析综合使用可以鉴别黄芪与伪品蜀葵、刺果甘草[26]，然而理化鉴别通用性不强，且切片法、气味和形态鉴别法较为主观，正确率不高，因此分子鉴别手段应运而生.崔占虎等利用ITS序列区分黄芪、红芪、紫苜蓿和蜀葵时发现，ITS序列可以用于黄芪与其伪品的鉴别[27]，不过该文中聚类树的部分分支支持率低于50%，结果并不是十分可靠.此外，高婷等人发现利用ITS2片段可作为黄芪属的DNA条形码，不过该文样品未包括本研究涉及到的伪品梭果黄芪[28]，因此，单一DNA条形码能否适用于其他黄芪属植物犹未可知.在此基础上，本研究采用ITS、rbcL和psbA-trnH3种通用DNA条形码对2种黄芪正品，6种伪品进行鉴别，进一步探究DNA条形码在黄芪正品与伪品鉴别中的应用.

rbcL基因具有通用性良好、易扩增、易比对的优点，该序列因自身序列进化速率较慢且碱基变化较少而在属以下水平的鉴别中的效果一般[29].本研究结果同样发现，单独使用rbcL条形码在属以下水平的鉴别效果不佳.

ITS片段分布广泛，常用于被子植物科内、近缘属种之间的研究.Han等使用DNA条形码对市面上295种1436份常见中药样品进行研究发现，ITS2序列的鉴别效率最高[30]；陈士林等人根据6000余份药用植物样品实验结果也得出同样结论，并推荐ITS2序列作为药用植物通用条形码，psbA-trnH作为后补条形码[31]，并且Mei等也验证了ITS2片段可用于艾与其伪品的鉴别[32].Zhang等应用ITS序列鉴别龙胆科蔓龙胆属的药用植物，验证了ITS条形码技术在药用植物鉴定中的有效性[33].但在本研究中，ITS序列的支持率较低，并且未能将黄芪属内的伪品与正品区分清楚，鉴别效果一般.

目前，一些学者基于ITS、ITS2序列寻找物种鉴别的SNP位点，马晓冲等共采集3个居群17份东方泽泻及3个居群19份泽泻，通过分析发现二者在第165bp的位置上存在稳定的A-T变异，可用于二者的鉴别[34].赵丹在开发白及与其伪品SNP分子标记时，共采收8个居群72份白及、10个居群103份黄花白及、5个居群30份小白及、3个居群15份华白及、6个居群58份独蒜兰、5个居群41份苞舌兰，并开发出3对仅可扩增出白及、黄花白及的引物[35].另有郑司浩等在膜荚黄芪与蒙古黄芪基源植物的特异性分子标记开发中，采集了膜荚黄芪5个居群45份、蒙古黄芪7个居群44份，发现在第476bp位置上存在稳定的C-T变异，蒙古黄芪为C，膜荚黄芪为T，成功设计出3对针对蒙古黄芪的特异性引物用于膜荚黄芪与蒙古黄芪的基源鉴定[36].这些基于SNP分子标记的研究，都需要多居群大样本进行分析.本研究的目的在于开发能够快速鉴别市场上常见黄芪正品与伪品的条形码，在样本量较小的情况下，DNA条形码比SNP位点分析更加简便快捷.

psbA-trnH基因是叶绿体基因进化最快的片段之一，但其序列普遍存在poly A-T，严重影响了其测序质量，适用范围因此受限.一些学者运用psbA-trnH分别鉴别百合科植物滇重楼、豆科鸡血藤及其近缘种、茄科酸浆属植物并取得不错的效果，且精度较高[37-39].但在本研究中，psbA-trnH基因也同样无法鉴别所有的黄芪正伪品.

Chase等在2007时提出单一DNA条形码鉴别效率较低，随即提出两种关于matK的组合条形码(rpoC1、rpoB和matK组合；rpoC1、matK和psbA-trnH组合)[40]，Burgess等也发现利用rbcL+matK组合的鉴别成功率高达91.4%，并且组合片段越多其成功率越高[41]，生命条形码联盟(CBOL)也曾提出将rbcL+matK作为陆生植物通用DNA条形码，ITS及psbA-trnH作为备选序列[42].国内亦有学者使用过组合条形码，不同植物往往需要不同组合的DNA条形码达到更好的鉴别效果，任保青等使用ITS+psbA-trnH鉴别桦木科桤木属的准确率可以达到88.5%，欧阳铖人等使用rbcL+ITS组合条形码在金合欢属物种的鉴别中成功率达到86.7%[21]；Tan等亦发现rbcL+ITS组合条形码能更好地鉴别中国西南地区亚高山森林草本植物[43].Han等使用ITS+psbA-trnH用于伞形科物种的鉴别成功率可以达到82%，明显高于单一DNA条形码[24]，Zhang等使用ITS2+psbA-trnH条形码可以成功鉴别雷公藤及其伪品，效果优于使用单一DNA条形码[44].

本次研究结果表明，单一DNA条形码在黄芪正品与伪品中的鉴别效果不理想，组合DNA条形码的鉴别效率及聚类树支持率均高于单一DNA条形码，rbcL+psbA-trnH，rbcL+psbA-trnH+ITS及ITS+psbA-trnH3种组合相对于rbcL+ITS组合条形码的鉴别效率而言，其正确率和效率均很高.

综上，任意单一DNA条形码都无法很好地独立用于全部黄芪正伪品的鉴定工作，rbcL、ITS、psbA-trnH各具优劣，rbcL的序列获取成功率较高，且在属以上的鉴定分析中准确率较高，但在属以下的分类单元中鉴定分析效果较差，3种单一DNA条形码均无法单独地将黄芪及伪品完全区分开.组合DNA条形码鉴别效率明显高于单一DNA条形码，可以用于黄芪正伪品的鉴别；鉴于rbcL+psbA-trnH和rbcL+ITS+psbA-trnH组合DNA条形码序列特异性强，建议将这两个组合作为黄芪标准的鉴别体系.