移植NAFLD患者和健康人粪菌对高脂饮食大鼠肠道菌群的影响*

骆庆玲,周永健,唐文娟,首第文,黄红丽,徐豪明,黄惠康,何 杰,杜艳蕾,阮焕梅,陈慧婷,曹创裕

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)被认为是目前世界上最多的慢性肝脏疾病[1-3]。使用肥胖人粪菌移植可促进小鼠肥胖[4],肠道微生态在NAFLD发病机制中的作用也得到重视。移植正常人粪菌是否能治疗NAFLD患者,或者说NAFLD患者粪菌是否为其致病因素,仍未得到证实【5-7】。本实验旨在探讨使用正常人和NAFLD患者粪便细菌移植给高脂饮食导致的大鼠,观察了动物肝组织的变化,现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物、药物与试剂 雄性SD大鼠32只,购自广东省医学实验动物中心。甲硝唑、万古霉素、氨苄青霉素、新霉素购自合肥博美生物科技有限公司。戊巴比妥钠购于德国默克公司,福尔马林溶液购于北京雷根生物技术有限公司,Qiagen DNA Stool Mini Kit试剂盒购于Qiagen公司。

1.2 药物和粪菌准备 抗生素混合液的制备：用无菌水配成含有浓度为0.4 g/L的氨苄青霉素,浓度为0.4 g/L的新霉素,浓度为0.4 g/L的甲硝唑和浓度为0.2 g/L的万古霉素水溶液。48 h内使用;高脂饲料配方：普通级饲料82.5%,猪油10.0%,蔗糖5.0%,胆固醇 2.0%,胆盐 0.3%,丙硫氧嘧啶0.2%。高脂饲料和普通基础饲料由广东省动物实验中心配制;粪便悬浊液的制备：收集3个健康人(符合粪菌移植供体筛选指标,且BMI为18～20 kg/㎡)的粪便,存于-80℃冰箱。每次取粪便20 g/人,室温解冻,以60 g粪便加生理盐水混匀,制成200 mL混合物,震荡5 min,经滤网过滤,将滤液静置5 min,吸取上清悬液50 mL,制成健康人粪便混悬液备用。收集3个NAFLD患者的粪便,存于-80℃冰箱,用同样方法制作NAFLD患者粪便混悬液备用。所选NAFLD患者均符合2018年中华医学会肝病学分会制定的《非酒精性脂肪性肝病防治指南》的诊断标准。

1.3 动物模型的制备 将32只大鼠随机分为4组,分别为对照组(A组)8只、模型组(B组)8只、NAFLD粪菌移植组(C组)8只和正常人粪菌移植组(D组)8只。第1周时,给予A组正常饮水,在B组、C组和D组给予抗生素混合液替代正常饮用水,抑菌。在第2～6周,给予A组普通饮水和普通饲料喂养,给予另三组普通饮水联合高脂高糖饲料喂养。同时,每周四和周日,给予B组大鼠生理盐水3 mL灌胃,给予C组NAFLD患者粪便悬浊液3 mL灌胃,给予D组正常人粪便悬浊液3 mL灌胃。实验第5 w,各组大鼠禁食不禁水12 h,称质量,给予0.5%戊巴比妥1 mL.kg-1腹腔注射麻醉。直视下经心脏取血。取肝脏左叶组织,一块组织用于常规病理学检查,另一块保存于-80℃冰箱备用。剪取全段结肠,沿纵轴剪开,生理盐水冲洗后放置-80℃中保存。

1.4 大鼠肠道DNA提取与测序 取-80℃冻存的大鼠肠粘膜,室温下解冻,约50 mg,使用 Qiagen DNA Tissue Mini Kit提取纯化肠粘膜DNA(含肠粘膜内菌群DNA),经Nano Drop初步检测,将浓度和纯度合格的DNA样品置于-80℃冰箱保存,用干冰运送至北京诺禾致源科技股份有限公司检验DNA完整性,取合格样品在Ill umina技术测序平台行16 sDNA菌群测序分析。

1.5 统计学分析 应用SPSS 20.0统计软件,计量资料以±s表示,组间比较采用单因素方差分析,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组肝组织病理学改变的比较 B组为重度脂肪性肝炎改变,大泡性脂肪变,越远离中央静脉,脂肪变越严重,可见玻璃样变,小叶边界有块状的炎症细胞浸润,可见部分片状坏死;C组为重度脂肪性肝炎改变,大泡性和小泡性脂肪变,可见玻璃样变,小叶边界可见较多的炎症细胞浸润,可见明显片状坏死;D组为重度脂肪性肝炎改变,中央静脉周围尚可见正常肝细胞和肝窦,小叶边界可见明显大泡性脂肪肝变,有炎症细胞浸润。

2.2 各组肠粘膜下菌群16sDNA的比较 基于属水平粪菌群OTUs分析,用脂肪肝患者粪菌处理过的大鼠肠道厚壁菌门高于用健康人粪菌处理组,表现在葡萄球菌属(staphylococcus,P=0.048,Z=2.042)、瘤胃球菌属(ruminococcus,P=0.028,Z=2.181)、产气荚膜梭菌属(clostridium perfringens,P=0.004,Z=2.746)增多;用脂肪肝患者粪菌处理过的大鼠变形菌门含量升高,表现在葡萄杆菌属(gluconobacter)和大肠杆菌属(Escherichia coli,P=0.016,Z=2.382和P=0.008,Z=2.548)增多;值得注意的是,模型组 clostridium-perfringers较对照组升高,而经过NAFLD患者粪菌处理组该菌含量明显升高(P=0.019,Z=2.362),而在正常人粪菌组该菌含量明显下降(P=0.004,Z=0.746);在NAFLD患者粪菌组Escherichia coli异常降低,与对照组形成差异(P=0.031,Z=2.362),Rothia-nasimurium明显高于模型组(P=0.029,Z=2.214,图1)。基于种水平粪菌群OTUs分析比较,NAFLD粪菌组变形菌门含量高于用正常人粪菌移植组,分别表现在脱磷孤菌种(Desulfovibrio,P=0.004,Z=2.717)、(Lautropia,P=0.048,Z=1.970)和某种未知的肠杆菌种(unidentified_Enterobacteriaceae,P=0.008,Z=2.548),其中NAFLD粪菌组Lautropia还较对照组和模型组升高(P=0.018,Z=2.349和P=0.043,Z=2.077)。NAFLD粪菌组变性菌门的Massilia较模型组和正常人组明显升高(P=0.020,Z=2.262和P=0.048,Z=2.042)。模型组变形门中的Rodentibacter较对照组升高(P=0.052,Z=2.008),而在用NAFLD粪菌组升高更为明显(P=0.019,Z=2.342)。NAFLD粪菌组厚壁菌门中的葡萄球菌种含量也相对模型组和正常人粪菌组升高(图2)。事实上,用人粪菌处理过的大鼠粪菌群,与未用人粪菌处理的大鼠存在明显的差异。在加入门水平物种组成的UPGMA聚类树图(图3)中,用脂肪肝患者粪菌处理后的大鼠肠道菌群与健康人粪菌处理者差异性最大,而从未经过人粪菌处理的大鼠之间肠道菌群差异性最小,用正常人粪菌处理的大鼠肠道菌群种类与对照组最为接近,而用NAFLD患者粪菌处理组与模型组最为接近。

图1 各组大鼠肠粘膜16sDNA测序分析 属水平的OTUs比较

图2 各组大鼠肠粘膜16sDNA测序分析 种水平的OTUs比较

图3 门水平物种组成的UPGMA聚类树图

3 讨论

本实验使用饲料应用了丙硫氧嘧啶,对加重肝细胞损坏,加速脂肪在肝细胞堆积起了作用[7-11],可能不是单纯的粪菌移植能够逆转的,这也与NAFLD患者常见的慢性发病情况不符。根据实验结果,我们推测如果减少丙硫氧嘧啶的用量,可能会导致脂肪肝造模时间延长,更符合普通人群NFALD的发病过程,也更能看到人类粪菌移植对大鼠肝脏病变的影响。

在实验观察过程中,NAFLD粪菌移植组和正常人粪菌移植组与模型组动物的进食量无明显差异,可考虑适当增加进食次数或者增加粪菌移植的次数,可能能更好地改善肝脏脂肪病变程度。临床上,采用的消化道喷洒、内窥镜下置管和口服菌群胶囊等方法,因实验动物体型较小,难以实行。故本实验采用灌胃方式,但胃酸可能会破坏一些菌群,而减少了菌群的作用。如果能进一步改进针对实验动物的粪菌移植方法,将更能看到粪菌移植对NAFLD大鼠的影响。

本实验将肠粘膜DNA用于分析大鼠菌群的变化,与用大鼠粪便DNA检测比,能更好地体现大鼠肠道内定植菌群情况[16]。在本实验中,通过比较肠道不同界门纲目科种属菌群情况,获得对NAFLD发病和治疗有意义的粪菌仍然很少。模型组肠道Rodentibacter种数升高,在移植NAFLD患者粪菌后该菌种树升高更显著,而在移植正常人粪菌后则大幅减少,说明Rodentibacter可能是促进NAFLD发生和发展的粪菌种。早先,已在小鼠认识到Rodentibacter的作用,可以通过影响Th1和Th2细胞的免疫功能,进而加重呼吸系统的炎症反应,加重疾病对机体的损害甚至增加了病死率[17],且身体疾病也会进一步增加Rodentibacter机会性感染的概率。NAFLD患者和NAFLD大鼠肠道Rodentibacter数量增加可能加重了肝脏病变,也可能是NAFLD发生增加了肠道Rodentibacter数量。Rodentibacter是否通过分泌相关毒素或者通过菌群移位的方式对肝脏造成影响,仍需要通过进一步实验验证。

虽然在基因水平上,SD大鼠已被证实与人类肠道菌群有2.47%配对重叠率,高于小鼠1.19%[18]。但事实上,大鼠和人类肠道菌群仍存在着比较大的差异。所以,用人类的粪便菌移植给大鼠,其对肝脏疾病造成的影响是否能代表人类肝脏疾病发展过程中菌群的作用,目前仍存在争议[19]。就像此次实验中发现的情况,用人类粪菌干预大鼠,大鼠肠道内的定植菌出现的差异性明显增大,出现了无论是用正常人还是用NAFLD患者的粪菌干预,均出现了某些菌群升高或降低的现象。但因在人体观察肝脏病理学变化仍然比较困难,肝脏穿刺是目前检测人类肝脏脂肪变性和纤维化的金标准,在临床实施过程中存在困难。所以,有关就肠道菌群相关的研究,动物实验依然是不可或缺的方法。

本研究再次证明肠道菌群的变化与NAFLD的发展有着明显的相关。我们还探讨了不同人群肠道菌群对NAFLD进展的促进或妨碍作用,得出了初步结论,我们认为NAFLD患者粪菌群可能是肝脏脂肪变性的一个危险因素,而应用健康人的粪便细菌干预可以改善高脂饮食大鼠肝脂肪变情况,降低血脂含量,减少肝脏内脂肪含量,减轻肝脏负担和损伤。这个结果对临床在用粪菌移植治疗脂肪肝的构想具有指导意义,提示用健康人粪菌群替代NAFLD粪菌群移植可以治疗NAFLD患者。当然,本实验发现大鼠肠道内定植菌群对疾病有显著影响者极少,而Rodentibacter可能是促进NAFLD发生和发展的粪菌种,我们未能发现能够逆转 NAFLD的有意义的菌群。