肉毒梭菌毒力以其毒素灭活疫苗的效力试验

秦绪伟 王景伟 王家栋

肉毒梭菌毒力以其毒素灭活疫苗的效力试验

秦绪伟 王景伟 王家栋

（齐鲁动物保健品有限公司 山东 济南 250100）

肉毒梭菌毒素毒力强，可以作为灭鼠的药物，现将肉毒梭菌C株菌液上清适当稀释，进行小鼠毒力试验。结果表明，肉毒梭菌C株菌液上清对小鼠的最小致死量为5.0×104MLD/ml，可以作为草原、牧场、其他养殖场灭鼠的参考依据。将毒素灭活制备疫苗，进行免疫小鼠，对小鼠具有保护力，可以抵抗致死量毒素的攻击。

肉毒梭菌 小鼠 毒力 毒素

肉毒梭菌是指能够产生肉毒梭菌毒素，引起动物中毒的细菌总称，其中C型肉毒梭菌最为常见，细菌呈现杆状或者略微弯曲，一般单个存在，革兰氏染色阳性。有周鞭毛，无荚膜，芽孢卵圆形[1]。肉毒梭菌毒力极强，1mg毒素纯品能使1万人或者4×1012只小鼠致死[2]。传统的食物肉毒中毒，有进食被污染的食物中已存在肉毒梭菌毒素引起[3]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 肉毒梭菌C株，购自中国兽医药品监察所。

1.1.2 试验动物 16~20gSPF级别昆明小鼠，购自山东大学实验动物中心。

1.1.3 耗材 培养基，肉肝胃酶消化汤培养基；TG小管、GA斜面、GP小管，肉肝汤半固体培养基、鲜血琼脂培养基等按照常规方法实验室配制；生化试验试剂、微量生化鉴定管购自北京陆桥技术有限责任公司。（1）成分以及比例：牛肉200g、牛肝50g、胃蛋白酶3~4g、盐酸10~11ml、蛋白胨10g、胡精10g、纯化水1000ml。（2）制备方法：在65℃左右温水内加入盐酸和搅碎的牛肉、肝，充分搅拌均匀，再加入胃蛋白酶充分搅拌，混合后的温度在56~58℃；置53~55℃消化22~24h，前10h每小时充分搅拌1次；提取上清液，加热至80℃，然后加入蛋白胨煮开，调节pH至7.6~7.8.煮沸10min，滤过或者经过沉淀后取上清，按照量加入糊精溶解后分装，116℃灭菌40min。

1.2 方法

1.2.1 肉毒梭菌的鉴定 （1）纯粹试验：取肉毒梭菌C株接种TG小管、GA斜面、肉肝胃酶消化汤培养基各2支，0.2ml/支，1支置37℃培养，1支置25℃培养，另取肉毒梭菌接种1支GP小管，0.2ml，置25℃培养，观察7d，记录细菌生长情况。（2）培养特性：取肉毒梭菌C株菌种接种肉肝半固体培养基、厌气肉肝汤培养基、厌气肉肝汤培养基(加新鲜的肝块)、鲜血琼脂平板(厌氧条件下培养)，37℃培养，观察细菌生长情况。（3）生化试验：①糖发酵试验：将待检菌株的新鲜培养物，接种糖发酵管培养基，37℃培养24~48h，观察糖发酵培养管的颜色是否变色，若变色则为阳性，不变色则为阴性；如为阴性，继续观察5d。如培养基仍仍然呈现未接种前的颜色，为阴性反应。②硫化氢试验：去待检菌株培养物，穿刺接种三糖铁琼脂斜面培养基，37℃培养48h，观察培养基底部是否出现黑色。培养基底部出现黑色即为阳性反应，未出现黑色为阴性反应。③过氧化氢酶试验：取干净的载玻片，在上面滴数滴3%过氧化氢溶液，挑取一环固体培养基的菌落，在过氧化氢溶液中混合均匀。若有气泡则为过氧化氢酶试验阳性，否则为阴性。

1.2.2 肉毒梭菌的培养 将肉毒梭菌C株菌种接种加入肉肝胃酶消化汤培养基，35℃培养5d，收获菌液，离心去除菌体，0.22um滤膜过滤除菌，-20℃冻存备用。

1.2.3 毒力试验 取肉毒梭菌C株毒素用明胶缓冲液进行5.0×10-3稀释，然后进行2倍系列稀释，每个稀释度尾静脉注射2只16~20g的SPF级昆明小鼠，0.2ml/只，连续观察5d，记录小鼠死亡情况。

1.2.4 疫苗制备 取第5代肉毒梭菌C株接种肉肝胃酶消化汤培养基，同时加入灭菌葡萄糖溶液，使其终浓度为0.5%，35℃静止培养5~7d，取样测定菌液上清毒素含量，菌液经甲醛灭活、脱毒完全后离心，去除菌体。用无菌生理盐水调整毒素含量为5万小鼠MLD/ml，与无菌氢氧化铝胶9:1比例混合均匀，再加入1%的硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01%，充分搅拌，制备疫苗。

1.2.5 疫苗效力 取16~20gSPF级别昆明小鼠25只，平均分成5组，每组5只，皮下接种制备好的疫苗，分别为0.5ml/只、0.1ml/只、0.05ml/只、0.01ml/只，共计20只，另外取5只条件相同作为对照，免疫后21d，免疫小鼠和对照小鼠分别进行静脉注射10只小鼠MLD肉毒梭菌毒素，连续观察7d，记录小鼠死亡情况。

2 结果

2.1 肉毒梭菌的鉴定

取接种肉毒梭菌的肉肝胃酶消化汤培养基菌液，进行革兰氏染色，结果镜检观察可见革兰氏阳性粗大杆菌。培养可见在肉肝胃酶消化汤半固体培养基中呈现中等生长，在厌气肉肝汤中生长不良或者不生长，培养基加入新鲜的肝块，生长良好，产气，有臭味。在鲜血琼脂平板上厌氧条件下，37℃培养48h，菌落不规则呈现圆形，直径3mm左右，半透明，边缘不整齐，有略大于菌落的溶血环。生化试验可见发酵葡萄糖和蔗糖，不发酵乳糖和麦芽糖，硫化氢试验培养基底有黑色，呈现阳性反应。过氧化氢酶试验结果不产生气泡，呈现阴性反应。

2.2 肉毒梭菌对小鼠毒力结果

取肉毒梭菌C株菌液上清使用，系列稀释对小鼠攻毒，攻毒后第2天小鼠开始出现四肢瘫软、无力、呼吸困难等症状；攻毒后第2天、第3天5.0×10-3稀释组、1.0×10-4稀释组小鼠全部死亡，攻毒后第4日2.0×10-4稀释组小鼠死亡1只。根据试验结果，该批毒素对小鼠的最小致死量为5.0×104MLD/ml(见表1)。

表1 肉毒梭菌对小鼠毒力结果

2.3 取肉毒梭菌菌种接种培养基

收取菌液灭活制备疫苗，免疫小鼠后21d攻毒，观察7d，可见0.5ml/只、0.1ml/只实验组小鼠全部健活，0.05ml/只实验组小鼠第3天死亡2只，其余3只小鼠健活，0.01ml/只试验组5只小鼠第2天全部死亡，对照组5只小鼠第2天全部死亡(见表2)。

表2 肉毒梭菌疫苗对小鼠免疫后攻毒结果 (ml/只、%)

3 讨论

（1）肉毒梭菌是广泛分布于环境中的一种细菌，存在于土壤、沼泽、水渠中，以及动物尸体和饲料中，在动物尸体和饲食物料中生长后产生大量的外毒素，一般不会造成传染，只会是吃食食物饲料引起中毒发病。（2）吃入肉毒梭菌也可以体内增殖生长产生毒素引起中毒，动物发病主要是动物吃腐败的动植物尸体，毒素污染的食物，引起中毒。肉毒毒素为蛋白类嗜神经麻痹毒素，阻断胆碱能神经末梢传递介质—乙酰胆碱的分泌和释放，使运动神经末梢麻痹。（3）中检所购买的肉毒梭菌C株使用肉肝胃酶消化汤培养，检测毒素毒力最小致死量为5.0×104MLD/ml。现在在很多草场也用于老鼠的杀灭，有的牧场、养殖场用于灭鼠。（4）预防本病主要是处理动物尸体，防止腐败的尸体成为动物饲料。人感染发病主要是饮食习惯有关系，欧美国家发病主要是肉类食品、罐头食品引起，我国的发酵食品臭豆腐、豆腐乳等都会引起本病，婴儿奶粉也曾检出过肉毒梭菌。疫苗免疫是本病预防的一个重要手段，中检所有规程产品，青海、西藏养牛使用效果确实。

[1] 陆承平. 兽医微生物学(第5版)[M]. 北京: 中国农业出版社, 2013: 192-202.

[2] 夏咸柱. 野生动物疫病学[M]. 北京: 高等教育出版社, 2011: 785-790.

[3] 周庭银. 临床微生物学诊断与图解(第2版)[M]. 上海: 上海科学技术出版社, 2006: 303.

（2019–10–12）

S852.61+6.3

A

1007-1733(2020)01-0008-02