海水养殖贝类病害预警预报技术及其应用

宋林生

(大连海洋大学 辽宁省海洋动物免疫学与疫病防控重点实验室，辽宁省海洋动物免疫学重点实验室，辽宁 大连 116023)

新中国成立70年来，中国农业实施“藏粮于地、藏粮于技”战略，在粮食安全方面取得了举世瞩目的成就。2018年，中国居民人均优质蛋白质的占有量猪牛羊肉46.8 kg、水产品46.4 kg和牛奶为22.1 kg，比1996年分别增加16.6、19.5、17.0 kg[1]，其中，水产品在改善人民生活质量、提升小康水平中发挥了不可替代的作用。

坚持绿色发展、保障粮食安全是中国的基本国策。中国是世界水产养殖第一大国，2018年水产品总产量为6457.7万t，其中养殖产量为4991.0万t[2]。水产养殖是中国海洋经济的重要组成部分，在促进渔业产业兴旺和渔民生活富裕、建设和谐社会、保障中国食物安全、提升国际市场竞争力等方面做出了突出贡献。近年来，由于全球气候变化和人类活动双重影响的加剧，近岸海洋和河口生态系统的结构和功能已经发生了历史性变化。中国海水养殖业养殖品种繁多，模式多样，随着养殖规模的不断扩大，长期危害养殖产业的病害问题日益突出。2018年，中国水产养殖因病害造成的经济损失约450亿元[2]。因此，开展病害防控研究，加快推进水产养殖业绿色发展，对于落实国家新发展理念、保护水域生态环境、保障国家粮食安全和建设美丽中国是十分紧迫和至关重要的。

预警预报是农业病害防控研究的热点及主流方向，近年来，国内外研究人员在农业灾害风险预警研究方面取得了重要进展，并将该技术广泛应用于农作物病害防控领域，有效增强了农业病害防控的预见性和计划性[3-7]。与农作物病害预警预报研究相比，中国水产动物病害预警预报体系的研究刚刚起步，主要工作集中在封闭或半封闭养殖系统，依据养殖水质的预测结果，对养殖动物病害发生情况进行测报[8-10]。水产动物的病害发生是病原、宿主与环境相互作用的结果[11-12]，因此，系统研究水产动物免疫防御机制，解析病原、宿主、环境间的耦合关系，是建立和发展疫病防控策略的核心。借鉴农作物病害防控的理论与技术，建立水产动物健康评价体系，加强水产动物养殖生态环境的监测及病害发生的预警预报已成为保障中国水产养殖业健康可持续发展、确保粮食和生态安全的迫切需求。本研究中，对国内外水产养殖动物病害预警预报领域的研究进展进行了综述，并结合团队在扇贝病害预警方面的相关工作，重点阐述了海水养殖贝类病害预警模型构建的思路、原理和初步应用，以期为发展和完善中国海水养殖业病害防控体系、保障海水养殖业绿色健康发展提供理论参考和技术支撑。

1 水产动物病害预警的技术原理及国内外研究进展

水产动物生活在水中，环境因素复杂，病害发生难以预见，且通过水质调节或药物投放控制病害流行的可操作性较低[13-14]。“预防为主，防重于治”是目前水产动物病害防控的基本理念，而水产动物病害预警预报体系的构建将有效预防水产动物疫病的发生、流行与传播，推动中国水产养殖产业的绿色健康发展。

1.1 水产动物病害预警预报体系的技术原理

预警源于预测，又是更高层次的预测[3]，其侧重于对警情发生的演化动态、方向及由此产生的后果等进行分析和预测[15]。广义而言，预警包含发现警情、分析预警、寻找警源、判断警度及排除警情等过程[15]。水产养殖动物病害预警预报是指在总结以往监测数据的基础上，系统分析各生物、非生物因素与水产动物病害发生及死亡的相关性，通过构建预警模型对病害的发生时间、范围、危害程度等进行预测并发布警示，指导生产活动，规避养殖风险。

借鉴农作物病害预警相关研究进展和成果，水产动物病害预警可分为明确警义、监测警兆、追溯警源、预报及排除警情等一系列相互衔接的阶段和过程[3,16](图1)。① 明确警义，即明确预警的研究对象，这是开展病害预警的前提。② 监测警兆，指对环境、病原及水产动物生理、免疫指标等与疾病发生和死亡密切相关因素的长期监测，这是构建预警预报体系的基础。③ 追溯警源，即分析警情产生的根源，发病原因越明晰，预警的准确度越高。④ 预报及排除警情，即利用分析模型预测结果，借助现代信息技术发布病害发生风险警示信息及可能的应对处置方案，最终排除警情。

1.2 水产动物病害预警预报体系的国内外研究进展

在长期进化过程中，水产动物为了适应复杂多变的水环境，形成了独特复杂的免疫防御机制。水产动物病害的发生是病原、宿主与环境相互作用的结果[11-12,17-22]，故预警预报体系的建立必须同时考虑这三方面的耦合关系和协同作用，厘清三者间的相互关系，选择关键因素作为预警系统的重要指标以大幅提高水产动物病害预警的可靠性。

1.2.1 病原 病原是引发水产动物疫病发生的最主要因素，也是病害预警研究的关键内容。研发病原的快速高通量检测技术，完善疫病诊断的标准体系，创新病害预警的综合分析技术，促进水产动物病害防控技术的转型升级，不仅是发展绿色养殖产业的迫切需要，也是保障水产动物食品安全的必然要求。

目前，国内外报道的水产动物病害预警模型主要是通过分析环境因子后对病害发生做出预测。由于水环境尤其是开放海域生态环境极其复杂，仅依靠环境因子进行病害预测可能会产生一定程度的偏差，故将病原的相关指标纳入预警系统，将会提高预测结果的准确性。水产养殖动物的病原主要包括细菌、病毒和寄生虫等，国内外已有关于病原相关指标应用于病害预警方面的研究报道。Powell等[23]构建了长牡蛎、寄生虫和环境相互作用的数学模型，并利用该模型准确模拟了两个海湾中养殖的长牡蛎群体感染寄生虫的时间和感染程度，为牡蛎寄生虫病的预警防控提供了技术保障。中国科研人员通过对大黄鱼养殖海域环境因子的分析发现，温度、溶解氧和化学需氧量是影响网箱养殖大黄鱼发病率的主要环境因子，并在此基础上分别针对刺激隐核虫和细菌病构建了网箱养殖大黄鱼的疾病预报模型，有效预测了疾病发生的等级[24-25]。中国水产养殖动物种类多，病原多样性丰富，病情复杂。其中，2018年监测到发病养殖种类66种，主要的养殖鱼类和虾类均有疾病发生。监测到的疾病主要包括鲤春病毒血症、草鱼出血病、传染性脾肾坏死病、锦鲤疱疹病毒病、传染性造血器官坏死病、病毒性神经坏死病、鲤浮肿病、鲫造血器官坏死病等鱼类疾病，以及白斑综合征、传染性皮下和造血器官坏死病、虹彩病毒病和肝肠胞虫病等虾类疾病[2]。开展养殖动物疫病监测与诊断、病原致病机制、病原鉴定和快速检测技术研究，筛选病原警兆指标，构建全面可靠的水产动物病害预警系统，是水产养殖动物疫病防控的重要方向。

1.2.2 宿主 水产动物进化形成较为完善的免疫系统来抵御病原的侵染，其生理状态和抗病力是决定病害发生的关键因素。免疫识别是机体识别和阻止病原感染的第一道防线。水产动物主要通过被称为模式识别受体(Pattern recognition receptors,PRRs)的免疫识别分子识别入侵的病原[26]。目前，已在水产动物中鉴定出十几类PRRs，主要包括肽聚糖识别蛋白(Peptidoglycan recognition proteins,PGRPs)、C-型凝集素(C-type lectins,CTLs)、纤维蛋白原相关蛋白(Fibrinogen-elated proteins,FREPs)、含C1q 结构域蛋白(C1q domain containing proteins,C1qDCs)、清道夫受体(Scavenger receptors,SRs)、含免疫球蛋白结构域的细胞黏附分子和Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)等[27-28]。免疫识别过程是激活机体免疫应答反应的首要步骤，免疫识别信号能诱导机体的细胞免疫和体液免疫以抵抗或清除病原。细胞免疫主要包括吞噬作用(phagocytosis)、包囊作用(encapsulation)、结节形成(nodule formation)和凝集反应(aggregation)或凝结反应(coagulation)等过程。病原侵染也能激活水产动物体液免疫，主要包括激活Toll、Janus激酶/信号转导与转录激活子(Janus kinase signal transducers and activators of transcription,JAK-STAT)、丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)、补体(Complement system)和肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)等免疫信号通路，进而促进多种免疫效应分子如细胞因子和抗菌肽等的合成，并通过与细胞免疫协同作用共同清除病原，维持自身稳态[26,28-29]。

目前，一些重要的免疫、生理生化和代谢指标可用于指示水产动物健康状态及环境胁迫强度，也因此被筛选为指示水产养殖动物病害发生的候选警兆指标。例如，鲈细胞因子(TNF-1,Interleukin (IL)-1β,IL-8)的转录水平和抗氧化酶活性在受到高温和低氧诱导后显著升高[30-31]。草鱼呼肠孤病毒能诱导草鱼体内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)合成和杀伤细胞中自噬小体的形成[32]。斑马鱼的凝集素和胸腺肽在受到脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)、脂磷壁酸(Lipoteichoic acid,LTA)或嗜水气单胞菌刺激后呈现升高的趋势[33-34]。在亚硝酸胁迫下，对虾肠道中ROS、过氧化脂质和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量，以及超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、过氧化物酶(Catalase,CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidas,GPx)活性显著升高[35]；受到硫化物刺激后，对虾肝胰腺的糖原、血清葡萄糖、乳酸含量及乳酸脱氢酶活性显著降低[36]；暴露于Cu条件下，对虾血淋巴细胞的凋亡水平和SOD活性显著升高[37]；受到病原菌刺激后，对虾血淋巴细胞中的多种PRRs(如CTL和Toll)、激酶(MAPK)、关键转录因子(Dorsal和Stat)和抗菌肽显著升高，血淋巴细胞的吞噬能力显著升高[38-41]。中华绒螯蟹血淋巴细胞中的半胱氨酸天冬氨酸酶Caspase-3/7-1转录水平在嗜水气单胞菌、LPS和过氧化氢(H2O2)处理后显著升高[42]，LPS能诱导中华绒螯蟹血淋巴细胞发生凋亡[43]。使用亚致死温度短期处理牡蛎，可激活机体热休克蛋白(Heat shock proteins,HSPs)大量表达[44]，从而有效降低病原感染造成的死亡。贝类酚氧化酶的活性水平受环境中有机/无机污染物的显著影响[45]。水产动物的这些免疫、生理生化和代谢指标对水体环境的变化较为敏感，可作为监测水产动物疾病和水体环境的潜在标志物，应用于水产动物病害的预警预报。

1.2.3 环境 在病原、宿主与环境三者相互作用过程中，环境因子不仅影响病原微生物的群落组成和致病能力，还能诱发改变宿主的生理和免疫状态，因此，在水产动物病害的预警预报中占据重要地位。

2 北黄海和渤海养殖贝类病害预警预报模型构建及应用

水产养殖业已成为北黄海和渤海地区海洋产业的重要组成部分，其中，牡蛎、扇贝、鲍、蛤等贝类是北黄海和渤海海域的主导养殖品种。近年来，养殖贝类的病害时有发生，且难以发现、诊断和治疗，已成为制约北黄海和渤海贝类养殖产业稳定发展的瓶颈。构建养殖贝类的病害预警体系能够有效地指导实际生产，规避或减少因病害发生导致的经济损失，确保贝类养殖产业的健康发展。目前，国内关于海水养殖贝类病害预警预报体系的研究和报道较少，国家贝类产业技术体系病害控制功能实验室组织相关科研力量，开展了海水贝类病害预警体系的研发工作，针对北黄海和渤海贝类养殖海区的生态系统特征及贝类养殖现状，解析了环境、病原及宿主健康状态与病害发生的关系，筛选了病害预警的警兆指标，构建了病害预警模型，初步实现了贝类病害预警体系的推广应用。

2.1 贝类病原相关的警兆指标

近年来爆发的贝类疫病主要包括弧菌病、细菌性溃疡病、脓包病、气单胞菌病、才女虫病等，主要由细菌、病毒、寄生虫和真菌等病原引发[2,22,50-53]。贝类通常养殖于浅海、滩涂等开放海域，难以通过投放药物或改善水质等措施控制和消灭病原微生物。因此，检测开放养殖水体的微生物群落结构，监测病原微生物丰度的变化，构建病原相关的预警测报系统，是贝类病害预警预报，实现有效防控的重要内容。

中国养殖贝类病原的研究主要集中在重要病原数据库构建、病原致病机制探索和快速高通量检测技术研发。研究者建立了鳗弧菌Vibrioanguillarum、溶藻弧菌V.alginolyticus、迟缓爱德华氏菌Edwardsiellatarda、灿烂弧菌V.splendidus、副溶血弧菌V.parahaemolyticus、荧光假单胞菌Pseudomonasfluorescens和恶臭假单胞菌Pseudomonasputida等贝类常见病原菌的快速特异检测方法，制定了贝类派琴虫病、鲍疱疹病毒病、牡蛎包纳米虫病、单孢子虫病、马尔太虫病等的诊断规程。牡蛎疱疹病毒(Ostreid herpesvirus 1,OsHV-1)是导致全球贝类大量死亡的重要病原之一。对OsHV-1的流行病学研究表明，OsHV-1及其变异株急性病毒性坏死病毒(Acute viral necrosis virus，AVNV)能够感染扇贝、牡蛎、魁蚶等多种贝类[54-58]。目前学者已完成了OsHV-1基因组序列的测序[59-61]，揭示了其与宿主相互作用的机制[62-63]，并且研发了多种OsHV-1的快速检测方法[64-66]。已有研究表明，灿烂弧菌[50,67]、发光杆菌Photorhabdus和弗朗西斯氏菌Francisellatularensis[68]是北黄海养殖虾夷扇贝脓包病的主要病原菌。研究人员揭示了灿烂弧菌JZ6的低温适应和低温致病分子机制，研究了温度对灿烂弧菌溶血活性的影响[69-70]，并根据灿烂弧菌主要毒力因子金属蛋白酶Vsm基因建立了灿烂弧菌快速检测方法[71]。本研究团队自2012年起，跟踪监测了北黄海和渤海养殖区病原的种类和数量变化情况，通过监测不同季节贝类养殖水体中灿烂弧菌数量和弗朗西斯氏菌丰度的变化，发现在每年6月，即虾夷扇贝病害爆发前夕，养殖环境中的灿烂弧菌和弗朗西斯氏菌数量或丰度大幅增加。因此，选取了弧菌和弗朗西斯氏菌丰度等作为贝类病害预警模型的警兆指标进行长期跟踪监测，为预警预报模型的构建提供了重要的数据支撑。

2.2 贝类的健康状态指标

贝类缺乏基于淋巴细胞和抗体的获得性免疫机制，主要依赖固有免疫系统清除病原。目前的研究已初步明确了贝类免疫系统的基本分子组成，克隆获得500余个贝类免疫相关功能基因。确定了贝类免疫识别受体(FREP、SR、CTL、C1qDC、Toll、Leucine-rich repeats、DM9CP、Caspase等)、补体相关分子、肿瘤坏死因子、白介素、神经递质代谢酶及其受体、能量代谢关键激酶等基因在贝类免疫防御过程中发挥的重要作用[26,72-74]。病原侵染能引发一系列的细胞防御反应，包括细胞吞噬、凋亡、包囊化和结节形成等。研究者确认了鳃丝基部为长牡蛎潜在的造血位点，鉴定了颗粒细胞是长牡蛎发挥吞噬作用的主要细胞类群[75-76]。长牡蛎血淋巴细胞的吞噬作用能够启动氧化还原反应、溶酶体蛋白水解等抗细菌免疫反应[72,77]。

评价和确定养殖贝类的健康状态是病害预警预报体系的基础。近年来，本研究团队结合免疫学、生理学、分子生物学、生物化学等多学科理论与技术，探索建立了贝类健康状态的评价技术。发现病原侵染和环境胁迫可以诱导免疫识别、信号转导、免疫效应分子等的表达[78]。通过研究重金属、高温、氨氮、微生物刺激等多种胁迫对贝类免疫稳态的影响，发现环境胁迫和细菌感染双重压力可加速低能耗条件下的氧化损伤，从而造成贝类的大量死亡[79-81]。在急性高温胁迫条件下，长牡蛎肝胰腺的总能量储备和细胞能量分配(Cellular energy allocation,CEA)显著下降，高温胁迫干扰了长牡蛎免疫应答和能量代谢相关基因的正常表达，打破了代谢平衡，导致长牡蛎在夏季的免疫能力下降，易出现大规模死亡[79]。细胞凋亡是贝类在逆境下实现自我保护的重要机制之一[82]。长牡蛎在干露状态下可通过多种方式维持胞内稳态，其中，泛素化修饰、DNA损伤修复及MAPK通路在胁迫应答中可能扮演着重要角色[83]。通过分析这些生理及免疫相关指标与养殖贝类健康状态的关联性，筛选出部分免疫因子、抗氧化分子、不同血淋巴细胞类群比例、儿茶酚胺、CEA、能量代谢底物、总抗氧能力(Total antioxidant oxyradical capacity,T-AOC)等作为养殖贝类健康状态评价的候选指标。根据长期连续跟踪监测数据分析及预警预报模型的拟合与优化，进一步筛选了SOD活性、MDA含量及闭壳肌糖原含量等作为贝类健康的警兆指标。

2.3 环境因子与贝类病害发生的关系

环境风险预警是水产动物病害预警的重要方面，是突破水域环境控制、实现生态优先养殖的关键环节。北黄海和渤海的贝类养殖主要以近海浮筏吊养为主[84]。北黄海和渤海养殖海区的环境因子具有较明显的季节性变化特征，且与全球气候及人类活动息息相关[85]。根据北黄海和渤海贝类养殖海区的生态系统特征及贝类养殖现状，本研究团队对海区水文、无机盐、藻相、微生物群落等生态环境指标进行连续跟踪监测，通过分析养殖海域主要环境因子的年际及季节性变化规律后发现，温度、溶解氧、硝酸盐和硅酸盐是影响浮筏养殖虾夷扇贝生长的主要环境因子(图2)；水温、叶绿素和溶解氧显著影响细菌的群落结构，通过分析贝类养殖海区浮游藻类群落的季节性演化规律后发现，在虾夷扇贝病害高发季节，海水中叶绿素含量和硅藻丰度较低，而甲藻等有害藻类丰度较高[86]。最后研究筛选了水温、叶绿素、溶解氧、硝酸盐和硅酸盐浓度、浮游藻类丰度等作为贝类病害预警模型的警兆指标进行长期监测。

2.4 海水养殖贝类病害预警数学模型构建与优化

自2009年开始，本研究团队对北黄海和渤海虾夷扇贝及海湾扇贝养殖区开展了连续监测工作，通过分析病原、宿主与环境之间的耦合关系，构建了病害预警模型。同时对一大批候选警兆指标进行筛选，最后选择海水温度、叶绿素含量、弧菌丰度，以及养殖动物总抗氧化能力、闭壳肌糖原含量等指标作为输入样本(即警兆)。基于MATLAB的BP神经网络进行数据建模，以死亡率指标作为预测样本(即警情),根据输入样本和预测样本分别建立输入数据矩阵和目标数据矩阵，并利用原始数据矩阵对输入网络进行初始化，初步构建了虾夷扇贝病害预警预报体系。通过对输出矩阵中的预测死亡率和实际死亡率进行绘图比较，发现两组数值曲线几乎重合，与预期结果相一致(未发表数据)。拟合的源代码能有效利用已知环境、病原及养殖贝类指标数据，可用于目标警情(死亡率)的预测。

2.5 海水养殖贝类病害预警系统的初步应用

虾夷扇贝为冷水性贝类，20世纪80年代初由日本引进到中国后迅速发展成为北黄海的主导养殖对象。近年来，虾夷扇贝大规模死亡问题引起了广泛关注。目前认为病害是导致筏养虾夷扇贝大规模死亡的主要原因之一，水温是重要的诱导因素。针对北黄海虾夷扇贝产业存在的问题，本研究团队连续多年对浮筏养殖的虾夷扇贝及海区进行了跟踪调查，筛选了海水温度、溶解氧、弧菌数量及丰度、硅藻丰度，以及扇贝闭壳肌糖原、MDA含量、SOD活性等作为警兆指标，构建了虾夷扇贝的病害预警预报系统，并对以上警兆指标实行长年跟踪监测。2019年7—8月，在示范站点监测到海水温度、溶解氧、弧菌数量与丰度、糖原含量、MDA含量等指标出现警情。在此基础上，联合大连市气象局，综合分析了未来10天该地区的气候变化趋势，利用大连市气象局微信公众号，连续3次发布了浮筏养殖虾夷扇贝风险提醒，有效规避了扇贝大规模死亡的发生。

抑食金球藻Aureococcusanophagefferens是海金藻纲的一种微微型浮游植物，具有抑制贝类摄食的能力，是连续20余年在美国东海岸引发褐潮的主要原因藻种。2009年始中国渤海海域频繁爆发以抑食金球藻为主的褐潮，对海水贝类养殖造成巨大危害。本研究团队针对抑食金球藻研发了Taqman探针快速定量检测方法，开展了全国贝类养殖海区抑食金球藻普查工作，有效跟踪监测了贝类养殖海区抑食金球藻的变化情况。针对秦皇岛海域由抑食金球藻引发的褐潮爆发事件，本研究团队自2010年开始连续关注秦皇岛海域水色异常、扇贝滞长问题，以海水温度、抑食金球藻浓度及扇贝闭壳肌糖原含量等作为警兆指标，构建了预警系统，并根据连续监测情况，多次发布《关于秦皇岛海域出现抑食金球藻的情况通报》、《关于秦皇岛海域海湾扇贝滞长及死亡的预警通报》、《关于秦皇岛海域抑食金球藻藻华爆发的情况通报》等褐潮预警预报信息，提醒有关单位密切关注藻华动态，积极采取规避措施，避免对养殖业造成重大经济损失。

3 展望

近年来，中国在海水养殖贝类病害预警预报体系研究方面取得了重要进展，部分研究成果已经进入国际前沿水平，但在整体上同国际农业病害预警水平相比仍有一定差距。围绕2019年国家10部委印发的《关于加快推进水产养殖业绿色发展的若干意见》中提出的新理念，水产动物防疫工作面临新的形势和新的要求。

(1)在理论研究方面，海水养殖贝类病害预警预报体系未来将借鉴人类医学及动植物疫病防控理论，有效综合免疫学、水产养殖学、微生物学、生态学、海洋学等学科领域的最新研究成果，深入解析病原致病机理、贝类的免疫防御体系，以及海域生境变化与贝类病害发生的关系，进一步完善水产动物病害预警的理论体系。

(2)在技术研发方面，海水养殖贝类病害预警预报体系要充分利用现代生态学、生物学及信息学等技术平台，研发警兆指标的快速高通量检测及实时在线监测技术，提升预警预报技术的准确性、灵敏性和时效性。

(3)在管理体制方面，相关部门应紧紧围绕水产养殖绿色发展这一主线，健全水产动物病害防控法律法规体系，完善水产动物疫病防控行政管理机构、水产动物卫生监督机构、水产技术推广机构及技术支撑机构建设，依法推进综合防治技术措施的落实与实施，为水产养殖业绿色可持续发展保驾护航。

(4)在队伍建设方面，积极发挥水产养殖病害防治专家委员会的决策咨询和引领作用，加强水产动物医学高等教育体系建设，扩大渔业执业兽医和渔业乡村兽医等队伍，提升专业队伍的理论和技术水平。

加快推进产学研等跨部门、跨学科、跨领域的协作运行，构建一个“上下贯通、横向协调、运转高效、保障有力”的水产动物疫病防控体系，将为全面指导中国海水养殖业绿色可持续发展提供理论支撑和技术储备。