双功能聚合物基质阳离子交换固定相的制备及其在离子色谱中的应用

张 恺, 支明玉, 何 艺, 朱 岩, 曾秀琼, 寿 旦

(1.宁波大学科学技术学院, 浙江 宁波 315212; 2.杭州职业技术学院, 浙江 杭州 310018; 3.浙江大学化学系, 浙江 杭州 310028; 4.浙江省中医药研究院, 浙江 杭州 310007)

阳离子交换色谱(CEC)作为离子色谱(IC)的一个分支,已成为目前检测阳离子型化合物的重要方法之一。当目标物质的基体组成较为复杂时,阳离子交换色谱与传统的原子吸收光谱法相比,是更加合适的分析方法[1]。同时,阳离子交换色谱能实现对不同价态的金属离子以及有机胺类的定量分析,这也是其他阳离子检测手段所不具备的能力。作为离子色谱的核心部件,离子交换色谱固定相一直以来受到了研究人员的广泛关注。与阴离子交换固定相不同,用于现代离子色谱的阳离子交换固定相多采用羧酸、膦酸等弱酸性基团作为离子交换功能基[2-5],其所需的修饰密度较大,对接枝、涂覆工艺手段具有较高的要求。近年来离子交换色谱固定相的进展以阴离子交换固定相为主,新型阳离子交换固定相的报道比较少见,整体发展趋势并不均衡。

“巯基-烯”点击化学修饰方法反应条件温和,具有高度的选择性和反应效率,被广泛应用于亲水作用色谱以及混合模式色谱等固定相的制备当中。成晓东等[6]将不同比例的氨基和巯基化硅烷偶联剂键合到硅球表面,再利用巯基与乙烯基膦酸进行点击修饰,得到正负电荷可调控的亲水作用色谱固定相,应用于多种极性化合物的分离;胡静等[7]将半胱氨酸点击修饰到乙烯基化580 nm粒径硅球表面,得到亚微米亲水作用色谱固定相,应用于加压毛细管电色谱中。“巯基-烯”点击化学正交性好,且易于模块化,使之非常适合于多元功能基的修饰,用于混合模式色谱。王晓欢等通过巯基化微球和苯乙烯型极性化合物间的“巯基-烯”反应,分别制备了反相/阳离子交换[8,9]以及反相/阴离子交换[10]混合模式固定相,应用于多种色谱分离模式,并考察了极性化合物的保留机理;吕倩楠[11]将半胱氨酸点击修饰到聚倍半硅氧烷微球,制备得到了反相/亲水作用色谱固定相,应用于中草药中活性成分的分离;王照地等[12]在硅胶颗粒表面分别进行C18键合以及C10-羧酸的点击修饰,制备得到反相/亲水作用色谱固定相实现了多种碱性药物的高效分离。此外,Peng等[13]将硫代苹果酸修饰到乙烯基硅球表面,制备得到了二元羧酸键合的新型弱阳离子交换固定相,首次将“巯基-烯”点击修饰方法应用到非抑制型离子色谱当中。

二乙烯基苯型聚合微球与传统的硅球和甲基丙烯酸型微球相比,能完全耐受强酸或强碱性的淋洗液,因此完全满足现代抑制型离子色谱非常严苛的兼容性要求,具有显著的优势。不过,由于这种固定相基质的化学稳定性很好,其化学衍生修饰方法较为有限。目前常采用傅克烷基化、酰基化的方法[14-18]对微球进行改性,再做进一步的接枝以得到离子交换填料,其反应条件较为苛刻,步骤相对繁琐,而且还会引入金属离子催化剂的污染。近年来发展了惰性聚合物微球的“巯基-烯”的修饰方法[19,20]:使用含巯基的氨基化试剂在温和的条件下处理二乙烯基苯型微球,使之表面的残余双键与巯基发生点击反应,可以直接实现此类惰性聚合物微球的功能化;再通过简单的“环氧-胺”修饰,即得到多种接枝型阴离子交换固定相。单纯的“巯基-烯”修饰功能化密度较为有限,仅适用于容量较小的阴离子交换固定相。利用“巯基-烯”的自由基机理,以巯基化合物作为链转移试剂进行自由基聚合,是一种较为高效的接枝手段,被应用于硅胶基质的反相色谱[21]以及亲水作用色谱[22]固定相中。本文在聚合物微球“巯基-烯”修饰方法的基础上,使用不饱和羧酸和羧酸酐作为单体,巯基磺酸为改性剂,在乙基乙烯基苯-二乙烯基苯微球表面实现了“巯基-烯”聚合修饰,制备了含有羧基和磺酸基的高交换容量双功能基阳离子交换固定相,将其应用于离子色谱当中,对其色谱分离能力色谱以及离子保留行为进行了考察。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

ICS-3000离子色谱仪(美国Thermo Fisher公司,配备有四元梯度泵、电导检测池、CSRS300阳离子抑制器以及Chromeleon v7.2色谱工作站); Vario MICRO Cube元素分析仪(德国Elementar Analysensysteme公司); ESCALAB 250Xi X射线光电子能谱仪(美国Thermo Fisher公司); SU8010扫描电子显微镜(日本Hitachi公司); KQ-500DE超声清洗机(昆山超声仪器有限公司); SHZ-D(M)循环水真空泵(河南予华仪器制造有限公司); BAO-50A鼓风干燥箱(美国STIK公司); K-1959气动泵(德国Knauer公司)。

2-巯基乙基磺酸钠(MESANa, 98%)、丙烯酸(99%)、顺丁烯二酸酐(99%),以及偶氮二异丁氰(AIBN, 98%)购自阿拉丁生化科技股份有限公司;甲基磺酸(MSA, 99%,购自ACROS试剂公司)用于配制色谱用淋洗液;乙腈(色谱纯)购自Tedia试剂公司;实验用水均为电阻率大于18.20 MΩ·cm的二次去离子水(GenPure Pro UV/UF超纯水仪,美国Thermo Fisher公司)。色谱用标准样品均用分析纯试剂配制。

单分散聚合物微球乙基乙烯基苯-二乙烯基苯(EVB-DVB,交联度55%,粒径4.6 μm)通过两步溶胀法制备,具体参考文献[23-25]。

1.2 阳离子交换固定相的制备

1.2.1“巯基-烯”聚合修饰

以丙烯酸和顺丁烯二酸酐作为聚合的单体材料,MESANa作为链转移修饰改性剂对EVB-DVB微球进行“巯基-烯”点击自由基聚合。具体制备过程如下:首先配制溶解有1.44 g丙烯酸、1.96 g顺丁烯二酸酐以及0.1 g AIBN的10 mL乙腈溶液作为单体溶液,以及溶解有一定量MESANa的10 mL水溶液。在30 mL玻璃反应瓶中加入2.5 g EVB-DVB微球和单体溶液并充分混合均匀,随后再加入MESANa水溶液并充分混合均匀。混合液通氮气除氧,超声分散5 min并密封,随后置于65 ℃烘箱内反应6 h。待反应结束后,微球分别用乙腈、1%(v/v)MSA和纯水充分洗涤,除去过量的游离聚合物,得到阳离子交换固定相,以湿饼状态冷藏保存。若试样需要进行表征,则取少量,用乙腈充分洗涤后在60 ℃干燥箱中烘干。

图1 阳离子交换固定相的制备过程

如图1所示,制得的阳离子交换固定相具有双功能基,分别是由丙烯酸-顺丁烯二酸共聚物和MESA封端残基。其中,固定相的弱阳离子交换部分由共聚物链的羧基组成,强阳离子交换部分来自于共聚物链末端的磺酸基。通过改变MESANa的初始加入量,对固定相的强阳离子交换基团比例进行控制,以探究MESA残基对固定相色谱性能的影响。分别制备了3种阳离子交换固定相,计作CE-1、CE-2以及CE-3。它们的MESANa初始加入量分别为丙烯酸和顺丁烯二酸酐单体总量的3.8%、5.6%和7.5%(物质的量分数)。同时,还制备了对照组固定相,其中未添加巯基改性剂,计作CE-R。

1.2.2色谱柱装填

采用匀浆法对固定相进行装填,取约4 g(湿重)上小节中制备得到的固定相微球,分散于50 mL纯水中,超声均匀后倾入匀浆罐中;匀浆罐用纯水补满,拧紧固定后以30 mmol/L NH4Cl作为顶流液,气动泵保持40 MPa压力,将固定相装入不锈钢柱管中。除了对照组固定相采用200 mm×4.6 mm规格的柱管外,其余3种固定相均采用150 mm×4.6 mm规格的柱管。装柱完成后,固定相用50 mmol/L MSA在1 mL/min的流速下冲洗净化过夜,以便进行色谱性能的测试。

1.2.3色谱条件

配制不同浓度的MSA作为淋洗液,在1 mL/min的流速下进行色谱分离;进样量为25 μL;柱温为30 ℃。

1.2.4交换容量的测定

CSO3H=S/MS×5 000

(1)

其中S为含硫量(%),MS为硫的相对原子质量。固定相中的氧元素可认为来源自羧基、磺酸基以及吸收的水分。以EVB-DVB微球的含氧量作为空白,排除水分带来的干扰,则固定相的弱阳离子交换容量(μequiv/g)和固定相含硫量、含氧量满足如下关系:

CCOOH=(O-1.5×S-OEVB-DVB)/MO×5 000

(2)

其中O和OEVB-DVB分别为固定相和EVB-DVB微球中的含氧量(%),MO为氧的相对原子质量。EVB-DVB微球基质和4种阳离子交换固定相的氮、碳、氢3种元素的含量由元素分析方法测定(见表1);试样中的氧、硫两种元素的含量比例则通过X射线光电子能谱(XPS)确定。假设固定相完全由氮、碳、氢、氧和硫5种元素构成,可通过固定相的氧/硫比和其余元素的总含量计算出氧、硫两种元素的含量,然后根据交换容量计算方法分别估算出固定相的强阳离子交换容量和弱阳离子交换容量(详见表1)。

表1 阳离子交换固定相的元素含量以及估算的交换容量

EVB: ethylvinylbenzene; DVB: divinylbenzene; n.a.: not available.

图2 固定相微球的扫描电镜图像

2 结果与讨论

2.1 扫描电镜表征

使用扫描电子显微镜对EVB/DVB基质微球和阳离子交换固定相进行表征。如图2所示,微球的粒径在4.6 μm左右,单分散性良好;经“巯基-烯”聚合修饰改性后(见图2b),微球仍保持良好的单分散性和完整性,粒径和表面形貌均没有发生明显的变化,这表明离子交换功能基以非常薄的形态均匀地键合在微球表面。

2.2 阳离子交换容量与分离能力的对比

根据1.2.4节方法估算得到阳离子交换固定相的强、弱阳离子交换容量。根据表1, CE-1, CE-2和CE-3 3种固定相具有比较接近的弱阳离子交换容量,均为3 500 μequiv/g左右。3种固定相交换容量的差异主要体现在强阳离子交换容量上,随着巯基改性剂MESANa初始加入量的增加,固定相的含硫量由0.34%递增至0.42%,相应的强阳离子交换容量由53 μequiv/g增加至66 μequiv/g;作为对比,对照组固定相CE-R是采用自由基聚合直接接枝的弱阳离子交换固定相,其交换容量为1 600 μequiv/g左右,不足“巯基-烯”聚合修饰的二分之一。这说明巯基改性剂MESANa不但作为强阳离子交换功能基团的载体,也能提高聚合的效率,提升固定相羧基的含量。

图3 阳离子交换固定相的色谱图对比

2.3 色谱性能表征与评价

2.3.17种无机阳离子的等度分离

图4 7种无机阳离子的色谱图

2.3.2离子保留模型

根据线性溶剂强度模型(LSSM)[26],离子在交换树脂上的保留因子k的对数值与淋洗液中竞争离子浓度的对数值呈线性关系。在阳离子交换模式下,淋洗液浓度的对数值可等效为pH值,此时线性溶剂强度模型可表示为:

logk=C1+C2×pH

(3)

其中,C1、C2均为无量纲常数。相应地,在二次项模型(QM)中,保留因子k的对数值与淋洗液pH值呈二次关系,可表示为:

logk=C1+C2×pH+C3×pH2

(4)

其中,C3为无量纲常数。

以2.3.1节中的7种阳离子为目标离子,使用上述两种模型对3种固定相的色谱保留行为进行拟合。CE-1的线性拟合方程的相关系数(r2)为0.979 9～0.984 7; CE-2和CE-3线性拟合方程的r2均在0.99以上。如图5所示,固定相CE-1的色谱保留行为更加符合二次项模型;固定相CE-2和CE-3的色谱保留行为则与线性溶剂强度模型符合得很好(显然也符合二次项模型)。在阳离子交换固定相中,由于H+会抑制羧基的解离,其有效交换容量会随着淋洗液pH值的减小而减小。由于线性强度溶剂模型是将固定相交换容量作为定值近似处理的,使之在一定程度上与固定相的真实保留产生偏差。在拟合实验中,CE-1采用的是浓度较低的一组淋洗液(～15 mmol/L, pH 1.82),这与固定相的功能基的有效pKa值较为接近,因此交换容量变化程度较大,其色谱行为与线性溶剂强度模型偏离最明显。这种现象也与基于IonPac CS12色谱柱的一项研究结果一致[27]。

2.3.3有机胺的色谱分离与保留行为

图5 7种无机阳离子在固定相上的保留因子-淋洗液pH对数关系图以及色谱模型的拟合

图6 铵根离子、脂肪胺以及烷醇胺在CE-3上的保留因子-正辛醇/水分配系数对数关系图

借助梯度淋洗模式,使用CE-3对7种无机阳离子和3种脂肪族胺进行分离。如图7所示,10种阳离子均实现梯度分离,与等度淋洗模式相比,分离时间可缩短至24 min,显示出这种阳离子交换固定相具有很好的应用价值。

图7 10种阳离子在CE-3上的梯度分离色谱图

2.4 固定相稳定性评价

以CE-3为例,对其连续运行超过1 200个柱体积,期间进行9次进样,分离6种常规阳离子,考察交换容量(保留因子)、柱效(理论塔板数)以及柱床(背压)的稳定性。6种目标离子的保留因子k和理论塔板数的RSD值分别小于0.3%和1.7%,证明了功能基具有良好的化学稳定性;固定相色谱柱背压变化也小于0.6%,证明了柱床良好的机械稳定性。其余两种固定相也能在各自的工作条件下维持稳定的色谱性能,在数月中未见到交换容量损失和柱效降低。

3 结论

本文提出了基于“巯基-烯”聚合修饰的聚合物基质阳离子交换固定相的制备方法。以丙烯酸和顺丁烯二酸酐作为弱阳离子交换聚合单体,选用MESANa作为巯基改性剂提供强阳离子交换功能基,进行巯基参与的自由基聚合接枝,可一步得到新型双功能基阳离子交换固定相。该固定相具有良好的色谱分离性能,使用简单的强酸淋洗液即可完成碱金属、碱土金属离子的基线分离;若采取梯度淋洗模式,可在24 min内实现无机阳离子和多种有机胺的高效分离。本文提出的巯基改性聚合修饰方法具有简单、高效的特点。通过调节巯基改性剂的比例能够实现对固定相交换能力的调控,具有广阔的应用前景。

此外,若能在“巯基-烯”聚合修饰的基础上引入非功能性的亲水性单体,有望提升固定相亲水性,减少功能基脂肪链和固定相内核对阳离子的非特异性作用,从而改善疏水性阳离子的峰形,进一步提高固定相的柱效和分离能力。