细胞自噬在糖尿病溃疡创面愈合中作用的研究进展

麻华胆 郑爱甜 吴标良

【关键词】 分子病理诊断; 精准医学;个体化医疗

中图分类号：R446.8 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2020.02.013

精准医疗是在科技浪潮的推进下提出的，它通过基因组测序、生物信息、大数据科学等多学科交叉应用，为患者提供更加准确和精细的个体化医疗服务[1]。精准医疗对病理学提出新的挑战，更是注入了生机，以形态学为基础的传统病理诊断技术远远不能满足精准医学的临床需求，传统的病理学技术与分子生物学、信息遗传学以及蛋白质组学等多学科相互交叉相互渗透形成了分子病理学，可以为临床提供精准的医学信息和证据。因而，分子病理诊断是在传统组织病理学的基础上结合分子生物学及分子遗传学的研究成果，并采用相关的分子生物学技术逐渐发展完善起来的交叉学科，该学科主要运用分子和遗传学方法对肿瘤进行分子病理诊断和分类，设计和验证能够反映预测疾病发生、治疗敏感性、病情发展等方面的生物标志物，为临床医生提供有价值的患者个体化资料，从而做到有针对性的个体化综合治疗。分子病理学使其由传统形态病理诊断延伸到分子水平上的诊断和临床治疗的全过程，病理学从此迈向更综合更全面的病理学时代。在个体化医疗时代的驱动下，会有越来越多的分子病理技术被发现并逐步应用于临床[2～4]。

1 分子病理技术的发展概况

从整体上看，我国的分子病理诊断发展进程与国外基本呈同步趋势，20世纪80年代的原位核酸分子杂交是我国最早的分子病理诊断技术，国内病理学实验室首先用32P标记HBV-DNA作为探针，通过杂交反应测定肝炎和肝癌组织中HBV-DNA含量。而地高辛和生物素等非放射性标记技术应运而生，原位杂交技术得到迅速发展并应用于HBV、人乳头瘤病毒、结核菌、流行性出血热等检测中[5]。随后，越来越多的相关基因被发现，荧光标记原位杂交技术（FISH）、多种标记探针的原位杂交、原位杂交与免疫组化结合技术、Southern杂交等分子病理诊断技术应运而生，我国的分子病理诊断技术得到迅速发展。近几年，是分子病理诊断蓬勃发展的时期，FISH检测乳腺癌HER2基因扩增、突变扩增系统（amplification refractory mutation system，ARMS）法检测肺癌EGFR基因突变、p53基因和K-ras基因的突变等靶向治疗与诊断的分子病理技术迅速问世，越来越多的医院都开展分子病理诊断技术[6～7]。目前，我们医院也开展了HER-2、TERLALK、TOP2A、1P19Q和ROS1等十几种FISH基因检测，同时还开展甲状腺癌、结直肠癌和肺癌等肿瘤的相关基因检测，为临床精准治疗和靶向用药提供了大量准确的依据。

2 分子病理技术的应用进展

2.1 在感染性疾病中的应用

对感染标本直接进行病原微生物DNA或RNA的提取，通过高通量测序后进行生物信息比对和大数据科学分析，获得致病微生物的详细种属信息，为各种感染提供快速精准且全面深入的诊断报告，促进临床抗生素的合理应用[8]。分子病理技术测定感染源，比培养、血清学和组织学检测具有更高的灵敏度、特异性以及准确性。目前已应用在感染性疾病诊断及疗效判断的分子病理技术，包括采用原位杂交检测EB病毒编码的小RNA，PCR和反向点杂交法检测乳头状瘤病毒DNA，荧光定量PCR技术检测各型肝炎病毒DNA和RNA、人类单纯疱疹病毒DNA、结核杆菌DNA、肺SARS病毒RNA等，这些检测取得了很好的效果[9～10]。但是，由于分子病理在感染性疾病上的诊断和治疗相对延后，目前缺乏深入的基因功能研究，分子病理学迫切需要进一步研究和应用。

2.2 在遗传性疾病上的应用

分子病理在遗传性疾病中的应用越来越广泛。应用原位杂交对染色体和DNA水平进行病理诊断检测，可以进行组织定位。临床病理医生可以通过对患者的染色体、基因检测进行遗传病筛查与诊断，预测家族遗传病的发生。近些年，分子病理学在辅助生殖领域上得到广泛应用，胚胎植入前进行遗传学诊断与筛查，准确判断胚胎染色体是否异常，从而选择健康的胚胎移植，其主要流程有：①取3～5个发育第3天的卵裂球单细胞或发育第5天的囊胚滋养层细胞进行DNA提取与单细胞扩增;②对质检达到标准的扩增产物进行文库制备后再进行高通量测序;③生物信息学对结果进行分析和判读，判断胚胎是否正常，为胚胎移植提供参考[11]。目前，国内应用在遗传性疾病中的分子病理检测技术主要有高通量测序仪、荧光定量PCR技术、染色体核型分析、免疫组织化学技术、荧光原位杂交技术等，可以辅助进行胚胎植入前和产前遗传性疾病的筛查，神经系统、遗传性耳聋基因、生殖系统等诊断与筛查[12～13]。分子病理在遗传性疾病的应用上取得了巨大的进步，有新的致病基因和遗传病不断被发现，逐步应用于产前诊断，甚至应用于基因治疗，但是很多医院条件和发展状况限制，导致先进的分子病理技术只停留在实验室水平，没有能很好地运用于临床。

2.3 在肿瘤诊断与精准治疗中的应用

肿瘤分子病理诊断的其中一个重要方面是恶性肿瘤的靶向基因检测。目前，靶向基因检测技术主要有3类：荧光原位杂交方法、实时荧光定量PCR方法和测序法。其中ARMS实时荧光定量PCR，又称等位基因特异性PCR，采用突变扩增阻滞系统，与双环探针和特异引物两种技术结合，从而对含有突变基因的DNA样品进行检测。石蜡包埋组织标本提取的DNA大部分被片段化，导致检测结果缺乏准确性，ARMS法在设计上能够最大限度地缩短目标产物的长度，从而解决了这一难点。为了避免扩增产物的污染，易于在临床样品检测开展，运用实时PCR平台与ARMS结合，实现扩增时闭管操作，无需产物的后处理，操作简单。靶向基因检测在肿瘤病理诊断中发挥着举足轻重的作用，因为其具有定位准确、特异性强、敏感性高及形态与功能结合等特点。分子标志物在肿瘤病理诊断中的应用主要有以下几点：（1）提高病理诊断的准确性;（2）有助于确定肿瘤分期及判断患者预后;（3）有助于发现微小转移灶;（4）有助于指导肿瘤患者的治疗;（5）有助于遗传性肿瘤易感家族的辅助诊断;（6）有助于肿瘤相关致病性微生物的发现。肿瘤的诊断与治疗是分子病理在临床应用上最为广泛的领域，分子病理技术可以检测基因表达和基因突变，从而评价个体患肿瘤风险，筛选出易感人群，实现肿瘤的早期预防、早期诊断、判断预后及指导治疗，还可对疑难肿瘤进行诊断和分类、个体化诊治和预后评估等[14]。目前已知的肿瘤易感基因有视网膜母细胞瘤的Rb1基因突变、Wilms瘤的WT-1基因突变、宮颈癌的hTERC基因突变、家族性腺瘤性息肉（FAP）的APC基因突变、乳腺癌和卵巢癌的BRCA1基因突变、消化道肿瘤的ras基因突变、结直肠癌的KRAS基因突变、非小细胞肺癌的EGFR基因突变等，这些易感基因检测适合家族中有肿瘤病例的人群[15～16]。我国是一个肝癌大国，目前原发性肝癌发病率和病死率分列我国癌症的第4位和第3位。应用于治疗原发性肝癌的分子靶向药物索拉非尼，靶点主要为 PDGFR、RAF、KIT和VEGFR，常用于远处转移的或治疗不能手术切除的肝细胞癌。应用分子病理技术对肝癌进行分子诊断与分型以及肝癌异质性分析，深入揭示肝癌的病因与发病机制，通过分子或基因选择对靶向治疗进行有针对性地杀死恶性肿瘤细胞，具有“高效低毒”的特点，几乎不影响正常细胞，从而实现个体化治疗[17]。肺癌是全球范围内发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一，随着分子医学的进展，我们对肺癌的理解深入到基因层面，特别是肺腺癌，治疗方案可以精细到针对基因：EGFR突变肺癌、ALK阳性肺癌、ROS1阳性肺癌、BRAF阳性肺癌等。其中EGFR检测主要有高通量测序、ddPCR、ARMS等技术，高通量测序的原理是将待测基因打断成300 bp的DNA片段，通过核酸杂交技术，然后再利用PCR技术进行扩增，通过测序检测后实现高通量检测。ddPCR主要包括荧光信号分析和PCR扩增两部分，可通过分子信标直接检测出样品中所含等位基因的数量及比值。ARMS是依据不同的已知突变来设计出对应的引物，进而检测出有突变基因。根据分子病理诊断技术检测出某种基因的表达，了解肿瘤是否存在该基因的分子异常，以选择和确定合适的分子靶向治疗，肿瘤基因检测在一定程度上对临床诊疗方案的选择具有极其重要的决定性以及指导作用，医生依据每个肺癌患者肿瘤的个体特征进行个体化治疗[18～23]。准确的病理诊断是正确靶向治疗的前提，基于分子病理的肿瘤多基因检测的临床应用，可以辅助医生靶向用药并判断疗效。随着分子靶向药物的不断研发和应用，肿瘤的分子靶向治疗成为肿瘤治疗领域中的研究热点。在临床分子病理的诸多技术的肿瘤应用中，高通量将成为首要趋势，自动化程度也会越来越高[14，24]。然而，分子病理目前仍然处于快速发展的阶段，还有很多关键的分子机制尚未明确，导致其运用有一定的局限性。如何与常规病理相结合，发挥最大化的诊疗价值，是目前临床医生、病理医生急需解决的问题。

3 問题与展望

综上所述，随着精准医疗的发展日新月异，从分子水平上认识各种疾病病变的性质以及生物学特性，从基因水平上多角度、多方面揭示疾病的发生、发展和转归的高特异性和敏感性的分子病理诊断是临床发展趋势。分子病理可以实现分子分型，更好地探索疾病的危险因素，提升肿瘤的早期预防、精准诊断、靶向治疗、预后判断以及研究等方面的水平，真正达到个体化治疗。分子病理检测使传统病理诊断得到有益的发展和补充，两者互相结合、互相补充可以更精确、更深入和更全面地揭示疾病的本质特征。因此，病理学要不断吸收生命科学中的技术创新和新发现，努力实现个体化医疗时代的精准病理学要求。分子病理可凭借自身高灵敏度和特异性强的优势不断提高诊疗效果，指导多种疾病的个体化治疗，不断推动精准医学的发展进程[25～27]。

参 考 文 献

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（收稿日期：2019-10-21 修回日期：2019-12-06）

（编辑：潘明志）