青梗不结球白菜耐热性的抗氧化指标评估体系建立

邹凯茜 杨 衍 田丽波 商 桑 曾丽萍郭雪松 刘子记 朱国鹏

(1 海南大学园艺学院/海南省热带园艺作物品质调控重点实验室,海南 海口 570228;2中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/农业农村部华南作物基因资源与种质创制重点开放实验室,海南儋州 571737)

不结球白菜(Brassica campestrisL.ssp.chinensisMakino.)又称小白菜、青菜、油菜,属十字花科芸臺属,原产于我国长江中下游地区,品种资源丰富[1]。青梗不结球白菜是一种速生蔬菜,复种指数大,一年四季均可种植,非常适于保护地周年生产,在全国各地均有栽培,其种植面积约占蔬菜种植总面积的30%,主要集中在长江流域其及以南地区。青梗不结球白菜以其清爽的口感和丰富的营养价值,深受广大消费者青睐[2-4]。在海南等华南地区,人们在炎热季节更喜食绿叶蔬菜,但夏秋高温往往是叶用蔬菜生产的制约性因素,本地生产绿叶蔬菜不能满足市场需求,常采取异地供应措施,大幅度提升了蔬菜成本,导致菜价高昂。热胁迫也已成为限制全球蔬菜产量的一个重要因素[5-6],因此,研究不结球白菜耐热机制,选育耐热性强的不结球白菜对于解决高温季节蔬菜供应问题具有现实意义。

耐热相关生理研究中,对抗氧化物质有大量报道,胡俏强[7]和陈以博等[8]从生理生化角度对不同耐热性的不结球白菜进行了耐热性鉴定,发现超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化物酶(polyphenol oxidase,POD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、丙二醛(malondialdenhyde,MDA)含量与电导率可作为耐热鉴定指标。Fujita 等[9]发现甘蓝的POD 在38℃热激下仍能保持较高活性;吴国胜等[10]对大白菜的研究表明,高温导致其POD活性降低,CAT活性升高,耐热性强的大白菜品种POD活性高于耐热性弱的品种,且SOD活性在高温下也较为稳定;叶陈亮等[11]在大白菜耐热研究中提出,耐热品种的SOD、CAT和抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)活性上升,热敏品种SOD和APX活性均下降。由此可见,抗氧化物质在植物与热胁迫之间扮演着重要角色。

植物对高温的响应是敏感复杂的,涉及基因型、发育阶段、生理生化、外部环境等多个层次,选择合适的耐热品种的筛选与鉴定方法能极大提高筛选效率。多元统计法目前已广泛应用于黑麦草[12]、葡萄砧木[13]、辣椒[14]和偃麦草[15]等植物的抗逆性综合评价,而对于青梗不结球白菜的评价鲜见报道。利用主成分分析并结合隶属函数、计算综合评价D值的方法能够对众多指标进行降维,减少后期聚类的计算量,避免主观决断。本研究在前人研究的基础上,采用多元统计方法对高温胁迫下19个青梗不结球白菜品种幼苗的抗氧化相关指标进行综合分析,客观全面地评价各品种幼苗的耐热性,筛选出耐热性相对优良的青梗不结球白菜品种,并基于各指标与耐热性之间的关系建立不结球白菜耐热性评价的数学模型,以期为不结球白菜耐热性资源发掘和品种选育提供科学准确的评价体系。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本试验所用19份青梗不结球白菜种子资源详见表1。

表1 供试种子Table1 Seeds used in this study

1.2 试验方法

选取上述19份青梗不结球白菜品种的种子各140粒,55℃温汤浸种,适温催芽,60%露白时播种于基质体积比为泥炭∶蛭石∶珍珠岩=1∶1∶1的50 孔(1粒/孔)育苗穴盘,常规管理。当幼苗长至4～5 片真叶时,选取长势一致的幼苗置于人工气候箱均先按表2预处理方式进行处理,再分为两组,分别进行对照处理和正式处理,每处理3 次重复,每个重复18株,按完全随机区组排列。处理完成后,每个重复随机选取10株,根据全株叶片反卷及褪绿情况调查热害等级;每个重复随机选取植株第2和第3 片真叶剪碎并混匀称取目标质量,最后进行各项指标的测定。

表2 试验处理条件Table2 Conditions of experimental processing

1.3 测定项目及方法

热害指数(heating-injury index,HII)的测定参考刘维信等[16]和胡俏强等[17]的方法。每天对植株进行观察,根据叶片反卷及褪绿,统计叶片受害数量,再进行分级:0级:无热害症状,植株正常;1级:植株受害叶片数＜全株叶片数的1/3;3级:全株叶片数的1/3≤植株受害叶片数＜全株叶片数的1/2;5级:全株叶片数的1/2≤植株受害叶片数＜全株叶片数的2/3;7级:植株受害叶片数≥全株叶片数的2/3 或植株失去经济价值。按照公式计算热害指数:

热害指数=∑(各级株数×级数)/(最高级数×调查总株数)×100% (1)。

根据热害指数,将19个不结球白菜品种按照耐热性进行分类:≥91%为极弱,81%≤极弱至弱＜91%,69%≤弱＜81%,57≤弱至中＜69%,45%≤中＜57%,33%≤中至强＜45%,21%≤强＜33%,11%≤强至极强＜21%,0≤极强＜11%。

MDA含量测定采用硫代巴比妥酸显色法;抗坏血酸(ascorbic acid,AsA)含量测定采用二氯靛酚滴定法;POD活性测定采用愈创木酚法;CAT活性测定采用紫外比色法;苯丙氨酸解氨酶(L-phenylalanine ammonia-lyase,PAL)活性测定参考李合生[18]的生理生化试验指导方法;多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)活性测定参考朱广廉等[19]的植物生理学试验方法;SOD活性测定采用氮蓝四唑显色法;APX活性、谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase,GR)活性测定及此3种酶粗提液的制备,过氧化氢含量测定(H2O2),谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量测定均参考吴华[20]的方法;超氧阴离子自由基()产生速率测定采用李忠光等[21]的改进羟胺法。

1.4 数据处理

将原始数据录入Microsoft Office Excel 2010,按公照式(2)计算各指标耐热系数(热害指数除外),运用SAS 9.4软件对各品种各指标的耐热系数及热害指数进行ANOVA 方差分析、相关分析、回归分析、主成分分析,利用公式(3)、(4)计算隶属函数值(U),公式(5)计算权重(Wi),按照公式(6)计算综合指标值D,并进行聚类分析,从而评价各品种的耐热性。

隶属函数与耐热性呈正相关时,按照公式(3)计算;呈负相关时按照公式(4)计算:

式中,Xi:第i个综合指标值;Xmin:第i个综合指标的最小值;Xmax:第i个综合指标的最大值。

式中,Pi:第i个综合指标的贡献率。

2 结果与分析

2.1 高温胁迫下不结球白菜各指标耐热系数的方差分析及相关分析

由表3可知,不同品种的各指标耐热系数均不同程度的偏离1,说明不同品种对于热胁迫的响应存在较大的差异。根据各性状的平均值,37℃/27℃高温处理5 d后,19个品种GSH、H2O2含量和O·-2产生速率的耐热系数的平均值均小于1,说明高温胁迫下这些指标都较正常生长的对照组有所降低,而APX、GR、SOD、POD、CAT、PPO、PAL活性和MDA、AsA含量则较对照组高。

研究青梗不结球白菜品种的性状多样性发现,13个性状的平均变异系数为33.26%,其中APX活性变异系数最大,为65.558%,GR活性次之,PAL活性的变异系数最小,为13.214%。对各指标耐热系数进行单因素ANOVA分析发现,除产生速率在19种青梗不结球白菜之间存在显著差异(P＜0.05),APX、GSH、GR、SOD、POD、CAT、PPO、PAL活性,MDA、AsA、H2O2含量以及HII 均在不同品种之间存在极显著差异(P＜0.01),说明不同的青梗不结球白菜品种在耐热性上具有很好的遗传多样性,这13个指标都可以作为青梗不结球白菜耐热性的鉴定指标。

表3 19种青梗不结球白菜耐热系数及品种间变异分析Table3 Heat tolerance coefficient and variation among 19 varieties of green stalks non-heading Chinese cabbage

2.2 青梗不结球白菜各指标相关分析

对19种青梗不结球白菜的13个指标进行相关分析(表4),结果表明,各指标之间存在一定的正负相关关系。其中,APX活性耐热系数与GR活性、生成速率的耐热系数之间的相关系数分别为-0.518、-0.502 ,H2O2含量与SOD活性耐热系数相关系数为-0.498,均表现为显著负相关;PAL活性与GSH含量、HII与MDA含量的耐热系数之间的相关系数分别为0.562、0.462,均为显著正相关,H2O2含量与O·-2产生速率的耐热系数之间表现为极显著正相关,相关系数为0.604。由此可知,青梗不结球白菜抵抗热胁迫的反应是一个综合反应,单一指标不能准确解释各品种间的耐热能力,需要利用多元统计的方法评价不同品种的耐热性。

表4 青梗不结球白菜13个指标耐热系数的相关分析Table4 The correlation analysis of 13 indicators about heat-tolerance of non-heading Chinese cabbage

2.3 青梗不结球白菜各指标主成分分析

将各品种各指标数据进行主成分分析,对13个指标进行降维处理,根据特征值大于1的原则,得表5中5个主成分,对应5个综合指标,其对应的贡献率分别为22.6%、15.6%、14.7%、11.8%、9.7%,累计贡献率为74.5%,解释了全部74.5%的差异来源。各主成分中取绝对值大于0.35的特征向量为主要特征向量,因此决定综合指标1的主要有MDA(0.399)、H2O2(-0.416)、(-0.378)、SOD(0.388)、POD(0.424),决定综合指标2的主要有APX (- 0.513)、GR(0.412)、(0.357)、HII(0.377),决定综合指标3的主要包括GSH (0.512)、AsA (- 0.424)、PAL(0.525),综合指标4 主要由GR(-0.525)、CAT(0.510)决定,综合指标5 主要由AsA(-0.474)、PPO(-0.491)、HII(0.350)决定。

表5 青梗不结球白菜指标主成分分析Table5 Principal component analysis of the index of non-heading Chinese Cabbage

2.4 青梗不结球白菜综合指标隶属函数分析

将原始数据标准化后与特征向量值计算5个综合指标得分值(表6),综合指标值越大耐热性越强。根据各综合指标主要特征向量指标的正负相关性选择隶属函数的计算公式,计算各品种的综合指标隶属函数值,并得到其平均值,计算综合指标D值。耐热性与D值呈正相关关系,根据D值大小,对各品种耐热性进行排序,耐热性前五的品种分别是青16、青20、青2、青18、青21,耐热性弱的5个品种分别是青15、青8、青1、青5、青14)(表7)。

2.5 青梗不结球白菜耐热回归模型建立

将各品种所有指标耐热系数及热害指数(自变量)与D值(因变量)进行多元线性逐步回归分析,所有变量显著(P＜0.15)进入方程的有APX、MDA、AsA、POD、HII,共5个指标,最终获得如下最优方程:

D=0.752 75 - 0.021 90x1- 0.042 48x4- 0.034 08x5- 0.079 84x9- 0.225 61x13

其中,x1:APX;x4:MDA;x5:AsA;x9:POD;x13:HII。R2=0.908 3,信息量(Cp)= 2.182 6

通过回归方程预测D值并检验其精度,精度范围为77.5%～99.4%,其平均精度为93.2%,说明其预测精度高,可靠性强。

表6 青梗不结球白菜耐热系数主成分得分值Table6 Principal component scores of heat-tolerant coefficient of non-heading Chinese Cabbage

2.6 青梗不结球白菜聚类分析

根据表7中D值可以判断耐热性较强的品种有青16、青20、青2,耐热性弱的是青1、青8、青15。利用SAS 9.4软件,采用离差平方和法,依据D值对19份青梗不结球白菜进行聚类分析(图1),在R2=0.908时,将其聚为3类。第一类为青2、青18、青21、青17、青29、青20、青16,表现为强耐热;第二类为青12、青24、青26、青30、青28、青19,表现为中耐热;第三类为青1、青8、青15、青5、青14、青6,表现为热敏感。

2.7 综合评价

根据表3热害指数分级标准将青梗不结球白菜进行分类:青5、青15为弱耐热;青1、青8、青17、青19和青30 划为弱至中;青2、青12、青14、青26,为中耐热;青6、青24 划为中至强;青18、青21、青28、青29划为强耐热;青16、青20 划为强至极强。由图1可知,青17与青19 属于强耐热类,与热害指数分析结果有一定程度的差异,由此可见单凭热害指数不能完全评价青梗不结球白菜的耐热性,存在一定的单一性,借助多元统计分析可以从多角度综合评价青梗不结球白菜的耐热性。将聚类分析结果对进入回归方程的指标进行归类计算其耐热系数平均值得表8,结果发现APX、MDA、HII、AsA、POD 随耐热性的增强其值越小。因此,在进行37℃/27℃热胁迫5 d 处理时,可将APX、MDA、HII、AsA、POD 作为主要指标初步判别青梗不洁球白菜的耐热性。

图1 19种青梗不结球白菜D值聚类结果Fig.1 Clustering results of D value of 19 green stalked non-heading Chinese Cabbage

表7 青梗不结球白菜隶属函数分析及综合评价Table7 Membership function analysis and comprehensive evaluation of non-heading Chinese Cabbage

表8 各聚类的指标平均值Table8 Mean value of each cluster

3 讨论

目前对植物耐热性的研究已有很多报道。蔬菜植株受到高温胁迫时,体内会发生系列生理生化反应来适应高温胁迫,从而降低热害损伤,这是一个复杂的生理过程。近年来,多元统计分析方法被大量应用在多指标综合评价的研究中,如黄瓜耐盐性[22]、万寿菊属耐热与抗旱性[23]、甜瓜幼苗耐冷性[24]、苜蓿耐热性[25]、荔枝耐贮藏性[26]以及丛枝菌根真菌(arbu scular mycorrhizal fungi,AM)对煤塌区土质的影响[27]等,涉及了植物抗逆、果实品质以及微生物等多方面。多元统计分析有利地提高了指标分析的准确性,其中主成分分析结合隶属函数的分析方法被大量运用。

本试验通过对19种来源不同的青梗不结球白菜施以37℃/27℃持续5 d的高温胁迫,通过测定其抗氧化指标耐热系数发现,各品种除O·2-产生速率差异显著,其他指标在品种之间均达极显著差异;变异系数在13%～66%之间,变异度很大,说明不同的青梗不结球白菜品种在耐热性上具有很好的遗传多样性,这13个指标都可以作为青梗不结球白菜耐热性评价鉴定的指标。此外,本研究还发现,各品种GSH、H2O2含量和O·2-产生速率的耐热系数均值小于1,说明处理5 d时,高温胁迫处理的青梗不结球白菜总体含量低于正常生长的植株,这与前人研究[23,28-30]存在一定偏差,可能由于部分青梗不结球白菜耐热性强,能快速应对热胁迫引起的活性氧增加,自身抗氧化酶活性大幅提高进而清除活性氧,并建立新的低水平活性氧平衡,使活性氧水平低于正常植株。

本研究相关性分析发现,各指标的耐热系数之间存在一定的正负相关性,MDA含量的耐热系数与HII呈显著正相关,也验证了在热害胁迫处理下,热害现象越严重,细胞受损伤率越高,膜脂过氧化产物MDA含量越高,这与张娜[31]和付正来[32]的研究结果一致。H2O2与O·2-作为活性氧物质,热害胁迫处理下其耐热系数呈极显著正相关,APX活性与O·2-产生速率、SOD活性与H2O2含量的耐热系数之间均呈显著负相关。已知SOD与APX 均为活性氧清除相关的物质,其在抗逆性中起重要作用,一定程度上与耐热性具有正相关[33-35],其本研究中也存在一定相关性但并未达显著水平;本试验中GR活性与APX活性的热耐系数之间呈显著负相关,二者均能提高活性氧的清除能力,说明青梗不结球白菜受热害胁迫5 d,二者活性没有同时升高,APX活性在耐热性强品种中较耐热性弱品种低,与前人研究[35]存在差异,可能是热胁迫时间不同或者APX 不是清除青梗不结球白菜活性氧的主要酶,具体原因还有待于进一步研究。

本研究聚类分析中,青2、青18、青21、青17、青29、青20和青16 表现为较强的耐热性;青1、青8、青15、青5、青14、青6为热敏感型,该结果与热害指数结果不完全一致。由此可知,耐热性是一个综合性状,采用热害指数等单一指标不能准确评价青梗不结球白菜耐热性,这与周亚峰等[24]和韩瑞宏等[25]对种子资源的非生物胁迫评价结论一致。植物耐热机制复杂,不同品种之间存在性状差异,单一指标评价不能消除品种间的性状差异,会影响耐热性评价的准确性。

4 结论

本研究最终获得了耐热性强的品种青16与青20,在聚类结果的综合评价中APX、MDA、HII、AsA、POD与耐热性成反比,也为后续筛选耐热品种提供了直接鉴定指标。本研究获得的耐热性综合评价模型D=0.752 75 - 0.021 90APX- 0.042 48MDA - 0.03408AsA- 0.079 84POD- 0.225 61HII,其预测值与实际测定值一致,因此该模型可用于青梗不结球白菜耐热性综合评价模型。本试验筛选品种可为蔬菜种植户夏秋季节渡淡种植提供选择。本研究构建了不结球白菜耐热性与抗氧化指标的评估体系,并探究了抗氧化指标与耐热性之间的关系,这对加快今后不结球白菜的抗热育种具有重要意义。