黑毛组6种石斛药效成分分析及营养价值评价

王彦兵，周侯光，尹红星，李庆聪，王晓媛 *，李守岭 *

1云南省德宏热带农业科学研究所，瑞丽 678600；2广西大学农学院，南宁 530004

石斛属DendrobiumSw.是兰科三大属之一，其原种将近2000种[1]。王雁等著的《石斛兰》以兰科分类学家理查德·施莱赫特的分组系统为架构，采用被大多数学者所认同的分类变更，将石斛兰属整理为5个亚属40个组[2]。石斛早在《神农本草经》中就有记载，具有养阴生津、润肺明目、抗癌防老等功效[3]，此外，石斛还是优良的植物蛋白来源，具有较高的药用食用价值[4]。《中华人民共和国药典》(2015年版)收录了铁皮石斛D.officinale、金钗石斛D.nobile、流苏石斛D.fimbriatum、鼓槌石斛D.chrysotoxum及其同属近似种的新鲜或干燥茎作为中药石斛的来源[5]。由于石斛资源珍稀及收集困难，目前国内外关于石斛的研究主要集中在石斛组Sect.Dendrobium(如铁皮石斛、金钗石斛、齿瓣石斛D.devonianum)和顶叶组Sect.Chrysotoxae(如鼓槌石斛、密花石斛D.densiflorum)等几种广为人知的药用石斛种质上，对于其它石斛的研究相对较少。

黑毛组Sect.Formosae石斛因其幼时叶片和叶鞘覆盖黑色短毛而得名，作为珍稀石斛种质资源，我国境内共发现7种自生种。目前，国内外对黑毛组石斛的研究较少，主要集中在种质资源收集[6,7]、杂交育种[8,9]、组间鉴别[10,11]、成分鉴定[12-14]等方面，而关于其药效成分及营养价值评价的研究鲜有报道。本研究以黑毛组6种石斛为材料，对其药效成分多糖、醇溶性浸出物、石斛碱及17种氨基酸含量进行测定，并分析以上指标之间的相关性，旨在为筛选优良石斛种质和开发石斛资源提供科学依据。

1 材料与仪器

1.1 材料

供试材料均采自农业农村部瑞丽石斛种质资源圃保存的原生种石斛，经中国医学科学院药用植物研究所李标研究员鉴定，详情见表1。其中翅梗石斛、长距石斛、翅萼石斛为国内原生种，美丽石斛、龙骨石斛、处子石斛为国外原生种。供试材料于55 ℃烘箱内烘干，粉碎后过50目筛备用。

1.2 仪器与试剂

RETSCH MM400组织磨样器，济南泰和盈科商贸有限公司；HHS电热恒温水浴锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；D-37520 型高速离心机，德国Heraeus公司；ME204电子分析天平，上海恒勤仪器设备有限公司；TGL20MW台式冷冻离心机，湖南赫西仪器装备有限公司；Biochrom30+全自动氨基酸分析仪，大昌华嘉商业(中国)有限公司；SN251668生物芯片分析仪，美国伯腾公司；6890N气相色谱仪，安捷伦；G2X-9240MBE电热鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

葡萄糖对照品，批号110833-200904，中国食品药品检定研究院；石斛碱对照品，批号17012003，北京北纳创联生物技术研究院；萘、苯酚、无水乙醇、氯化钠等，国产分析纯；柠檬酸钠、茚三酮及甲醇(色谱纯)为进口试剂。

1.3 方法

1.3.1 多糖含量测定

参照2015年《中华人民共和国药典》(一部)铁皮石斛项下多糖含量测定方法进行测定[5]。

1.3.2 醇溶性浸出物含量测定

参照2015年《中华人民共和国药典》(一部)通则2201项下热浸法提取测定[5]。

1.3.3 石斛碱含量测定

参照2015年《中华人民共和国药典》(一部)金钗石斛项下测定方法分析测定[5]。

1.3.4 氨基酸含量测定

参照Wang等[4]方法，称取样品粉末0.2 g( 精确到 0.000 1) 于10 mL安剖瓶中，加入10 mL 6 mol/L盐酸溶液，测定除色氨酸以外的 17 种氨基酸。

1.3.5 营养评价方法

参考Zhu等[15]提出的方法计算氨基酸比值系数(RC)和氨基酸比值系数分(SRC)。

1.3.6 数据处理

所有试验平行重复测定3次，求平均值。所有数据经SPSS 20.0进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 多糖含量分析

黑毛组6种石斛多糖含量见表2，多糖含量在0.59%～17.08%之间。其中含量最低的是长距石斛，仅有0.59 %，最高的是翅梗石斛，为17.08%，两者相差将近三十倍；其次分别是美丽石斛、龙骨石斛、翅萼石斛、处子石斛，含量介于0.76%～4.8%之间；龙骨石斛和翅萼石斛多糖含量无显著性差异(P> 0.005，下同)，其余各石斛多糖间差异显著(P< 0.005，下同)。多糖是石斛的主要药性成分之一，若以药典规定铁皮石斛多糖不得少于25%的标准[5]进行评价，黑毛组6种石斛的品质偏低，并非是研究石斛多糖的良好来源。

2.2 醇溶性浸出物含量分析

黑毛组6种石斛醇溶性浸出物含量见表2，含量在7.62%～13.54%之间。醇溶性浸出物含量由高至低依次是翅萼石斛、处子石斛、长距石斛、翅梗石斛、美丽石斛、龙骨石斛；醇溶性浸出物含量最高的翅萼石斛是含量最低的龙骨石斛的1.78倍；翅梗石斛和长距石斛醇溶性浸出物含量无显著差异，其余各石斛醇溶性浸出物含量差异显著。醇溶性浸出物是石斛的主要药性成分之一，含量高低与药理作用有密切的关联，若以药典规定铁皮石斛醇溶性浸出物不得少于6.5%的标准[5]进行评价，黑毛组石斛醇溶性浸出物含量丰富，可作为研究石斛醇溶性浸出物的良好材料。

2.3 石斛碱含量分析

黑毛组6种石斛石斛碱含量见表2，均未检出。Luning[16]对548个兰科植物的生物碱进行测定，涵盖了120个不同种质石斛，其中翅梗石斛和长距石斛生物碱含量介于0.01%～0.10%；王再花等[17]采用酸性染料比色法比较研究了26种野生石斛和9个春石斛品种的生物碱含量，其中翅梗石斛生物碱含量均低于 0.01%。上述研究结果表明，部分黑毛组石斛中存在少量生物碱。石斛碱作为金钗石斛的特征成分，在所测的6种黑毛组石斛中均未检出，可进一步研究其中的微量生物碱。

表2 黑毛组6种石斛药效成分含量

注：“-”，未检出；同列数据后不同小写字母表示差异显著(P< 0.05)。

Note:“-”,not detected;values with different small letter within the same line have significant difference(P< 0.05).

2.4 氨基酸含量分析

黑毛组6种石斛17种氨基酸组成及含量见表3，氨基酸总量介于3.45%～4.53%之间，含量由高至低依次是美丽石斛、翅萼石斛、长距石斛、处子石斛、翅梗石斛、龙骨石斛。6种石斛样品中，天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸3种氨基酸含量最高，蛋氨酸、半胱氨酸和组氨酸含量偏低。

所测的17种氨基酸中必需氨基酸7种(Thr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Lys)，非必需氨基酸10种(Cys、Tyr、Asp、Ser、Glu、Pro、Gly、Ala、His、Arg)，6种石斛样品中必需氨基酸含量为1.22%～1.62%，非必需氨基酸含量为2.23%～2.97%。根据WHO和FAO提出的蛋白质理想模式，即必需氨基酸占总氨基酸百分含量为40%，占非必需氨基酸百分含量为60%以上[15]，6种石斛中有3种石斛接近理想模式，分别是翅梗石斛、长距石斛和翅萼石斛，说明这3种石斛的蛋白质是优良的蛋白来源，有较大的开发潜力。6种石斛还具有丰富的药用氨基酸(Asp、Glu、Gly、Arg、Met、Phe、Leu、Lys、Tyr)，含量为2.30%～3.06%。药用氨基酸与总氨基酸含量比值为61.94%～69.11%，平均值为65.22%，由高至低依次是处子石斛、美丽石斛、龙骨石斛、翅萼石斛、长距石斛、翅萼石斛。石斛自古以来在我国为中药材所用，分析其中的药用氨基酸组成和含量，可为黑毛组石斛药材质量评价和将其开发为药品保健品提供科学依据。

表3 黑毛组6种石斛氨基酸组成和含量(%)

注：T：氨基酸总量；a：必需氨基酸总量；b：非必需氨基酸总量；c：药用氨基酸。

Note:T:total amino acid;a:total essential amino acids;b:total non-essential amino acids;c:amino acids for medical purposes.

2.5 氨基酸营养价值评价

2.5.1 必需氨基酸组成成分分析

半胱氨酸和酪氨酸在体内可分别由蛋氨酸和苯丙氨酸转变而成，如果膳食中能够直接提供这两种氨基酸，则人体对蛋氨酸和苯丙氨酸的需求相对减少，所以WHO/FAO 模式值将它们分别合并计算。6种石斛必需氨基酸占总氨基酸的质量分数见表4。由表4可知，6种石斛的必需氨基酸总含量在40.84%～46.46%之间，明显高于 WHO/FAO 模式值35%，这表明黑毛组6种石斛蛋白质中必需氨基酸的含量丰富，食用价值较高。从单个必需氨基酸的含量分析，黑毛组石斛中苯丙氨酸+酪氨酸的含量最高(9.11%～11.03%)，作为药用氨基酸的组成成分，含量远高于WHO/FAO模式值。综上，黑毛组6种石斛蛋白具有一定的药用价值。

表4 黑毛组石斛必需氨基酸的组成成分及含量(%)

2.5.2 6种石斛必需氨基酸比值系数

必需氨基酸比值系数法是利用WHO/FAO的必需氨基酸模式，通过计算得到样品中RAA、RC、SRC，根据计算结果对植物蛋白营养价值进行直观评价。RC值可评价单个氨基酸组成比例，FAO/WHO模式单个氨基酸RC值为1，作为参照指标，样品中单个氨基酸偏大表示含量相对过剩，偏小表示含量相对不足，其中含量最低的为该样品第一限制氨基酸。由表5可知，美丽石斛的第一限制氨基酸为缬氨酸，RC值为0.83；龙骨石斛、处子石斛的第一限制氨基酸为亮氨酸，RC值分别为0.78、0.69；翅梗石斛、长距石斛、翅萼石斛3种国内原生种的第一限制氨基酸均为赖氨酸，RC值分别为0.79、0.85、0.87。

SRC作为综合评价指标，其值越接近100，表示RC值越集中，各必需氨基酸含量均衡，其营养价值越高。6种石斛的SRC值介于52.42～83.74，其中翅萼石斛中必需氨基酸SRC值(83.74)最高，处子石斛中必需氨基酸SRC值(52.42)最低。除处子石斛外的5种石斛中，必需氨基酸SRC值均高于70，可提供优质植物蛋白。

表5 黑毛组石斛必需氨基酸的RAA、RC、SRC比较

续表5(Continued Tab.5)

种类Species参数Parameter氨基酸种类Sort of amino acid苏氨酸Thr缬氨酸Val异亮氨酸Ile亮氨酸Leu赖氨酸Lys蛋氨酸+半胱氨酸Met+Cys苯丙氨酸+酪氨酸Phe+TyrSRCRC0.890.941.030.840.791.121.38长距石斛D. longicornuRAA0.050.050.060.050.050.060.0880.22RC0.890.901.030.860.851.071.40翅萼石斛D. cariniferumRAA0.050.050.060.050.050.050.0783.74RC0.920.921.010.920.871.001.35处子石斛D. virgineumRAA0.040.040.040.030.040.100.0652.42RC0.70 0.76 0.800.690.842.001.20

2.6 药效成分及营养价值相关性评价

利用SPSS 20.0软件对包括药效成分及营养价值在内的7个指标进行统计描述和相关性分析，结果见表6、7。从变异系数(表6)来看，多糖变异系数值最大，达到137.24%；氨基酸总量变异系数最小，为9.18%；其余各指标变异系数从高到低排列顺序为：醇溶性浸出物>SRC值>药用氨基酸>非必需氨基酸含量>必需氨基酸含量。由相关性分析可知(表7)，氨基酸总量与必需氨基酸含量呈显著正相关(P< 0.05)，氨基酸总量与非必需氨基酸、药用氨基酸含量呈极显著正相关(P< 0.01)，非必需氨基酸与药用氨基酸之间呈极显著正相关。以上结果表明，氨基酸成分存在一定相关性，而与多糖、醇溶性浸出物及SRC相互之间均无显著相关性。

表6 黑毛组石斛各指标描述统计分析

表7 6种石斛各指标相关性分析

注：“*”和“**”分别表示在0.05、0.01水平上显著、极显著相关。

Note:“*” and “**” indicate significant correlation at 0.05 and 0.01 level,respectively.

3 结论与讨论

组培快繁技术的发展，为保护稀缺植物资源提供了解决途径，同时促进了商业化推广[18]。我国石斛资源丰富，有81种，2个变种，具有较大的研究开发空间。黑毛组是石斛属12个组群中比较特殊的分类群，对其进行深入研究，有利于丰富石斛中药来源，同时对开发选育优良品种石斛和保护药用石斛种质资源具有重要意义。

石斛多糖具有抗氧化、调节免疫力、抗肿瘤、降血糖等功效，是石斛中重要的功能活性物质[19]；醇溶性浸出物是石斛的主要药效成分，包含黄酮类、多酚类、菲类、芪类和倍半萜等多种有效物质，具有优良的抗氧化性、抗肿瘤及耐药性等功效[20]；石斛碱是金钗石斛中主要的生物碱类，具有解热、镇痛等功效，具有较高的研究开发价值，目前在其它石斛中未发现大量存在[21]。不同种质石斛的药效成分及生物活性存在一定的相似性[2]，本研究以药典规定的铁皮石斛多糖、醇溶性浸出物及金钗石斛石斛碱含量为标准，对黑毛组6种石斛基本药效成分进行初步分析评价。结果表明，黑毛组6种石斛中多糖含量普遍偏低，介于0.59%～17.08%，含量最高的翅梗石斛与含量最低的长距石斛相差28.95倍，均低于药典规定铁皮石斛多糖不得少于25%的标准，若从多糖含量方面考虑，研究意义不大，可从生物活性角度对其进行研究。6种石斛中醇溶性浸出物含量介于7.62%～13.54%，均高于药典规定铁皮石斛标准6.5%，含量最高的翅萼石斛为标准的两倍，作为石斛的主要药性成分，黑毛组石斛较高含量的醇溶性浸出物为具体分析某一药效成分奠定了基础。6种黑毛组石斛样品中均未检出石斛碱，而相关文献中提到翅梗石斛和长距石斛含有微量生物碱[16,17]，后续研究将对其他生物碱进行分析鉴定。

石斛作为一种“药食两用”的植物，蛋白质含量丰富，氨基酸作为蛋白质的水解产物是评价其营养价值的重要指标[4]。氨基酸分析结果表明：黑毛组6种石斛均含有色氨酸以外的17种氨基酸，总量介于3.45%～4.53%之间，其中翅梗石斛、长距石斛和翅萼石斛接近WHO/FAO提出的理想模式(a/T = 40%，b/T = 60%)。6种石斛17种氨基酸中，天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸3种氨基酸含量最高，三者均是药用氨基酸组成成分。6种石斛的药用氨基酸与总氨基酸含量比值为61.94%～69.11%。必需氨基酸组成占氨基酸总量的40.84%～46.46%，较WHO/FAO模式值(35%)高；单个氨基酸含量中苯丙氨酸+酪氨酸的含量最高(9.11%～11.03%)，优于WHO/FAO模式值(6%)。6种石斛的SRC值介于52.42～83.74，除处子石斛外SRC值均高于70，接近或高于紫花苜蓿SRC值[22]，可作为优质植物蛋白来源。

药用植物有效成分含量与药效之间具有一定关联性。6种黑毛组石斛中，缅甸原生种与国内原生种药效成分及营养成分含量之间存在一定差异，表明其药效不尽相同，对不同种质应分别进行研究和开发。6种石斛中多糖变异系数最大(137.24%)，其次为醇溶性浸出物(18.95%)。石斛样品均来自同一资源圃，避免了不同生长环境的影响，药效成分差异较大的原因主要是由于种质基因的不同，这与其他种质石斛的研究结果一致[23]。相关性分析结果表明，营养成分之间存在一定相关性，而药效成分与营养成分及药效成分之间无显著相关性。组(Section)作为非正式分类阶元，仅从外观形态对黑毛组进行分类存在一定局限性，其分类、分组方法有待进一步研究。

本研究补充了石斛属植物药效成分方面的数据，为药用石斛的进一步研究开发提供了理论基础。由于样品较少及收集困难等原因，本研究未分析测定黑毛石斛组其它种质石斛的药效成分，有望在后续工作中逐步开展。