云芝糖肽发酵条件的响应面法优化试验

吴 宽, 米伟丽, 吴云锋

(1.杨凌职业技术学院，陕西 杨凌 712100；2.农业部西北黄土高原作物有害生物综合治理重点实验室，西北农林科技大学 植物保护学院，陕西 杨凌 712100)

植物病毒病是仅次于真菌病害的第二大类植物病害，给农业生产造成极大损失。目前我国已报道的植物病毒种类约1 100种，每年造成的危害达到600亿元，由于防治困难, 严重影响着农民增收和农业的稳定发展，素有“植物癌症”之称。因此，开发新型的微生物源抗植物病毒活性药剂具有重要的意义。

实验室前期从秦岭山分离获得杂色云芝菌(Trametes versicolor)，命名为秦岭菌株YZ5，通过单因素与正交实验设计获得了杂色云芝糖肽液态发酵基质配方的优化组成，进一步发现发酵产物云芝糖肽(PSP)具有抗烟草花叶病毒(TMV)功能[1]。然而，研究发现杂色云芝菌菌丝体内和体外都能够产生多糖，杂色云芝菌菌丝体发酵液中提取的胞外多糖是一种不含肽的葡聚糖[2]，从菌丝体中提取的胞内多糖是含蛋白质的糖肽，具有抗病毒活性[3～4]。需要探索秦岭菌株YZ5胞内多糖的发酵条件，目前尚未研究报道。

为提高杂色云芝菌液态发酵多糖产量，在单因素基础上，实验通过响应面法(RSM)以最经济的方式，较少的实验次数和较短的时间对发酵条件继续优化研究[5～6]，为实现云芝糖肽大规模工业化生产提供技术指标。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌 种 杂色云芝菌(Trametes versicolor)由农业部西北黄土高原作物有害生物综合治理重点实验室从秦岭山林地采集，鉴定与保存。

1.1.2 培养基 固体培养基：马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)

液态基础培养基：葡萄糖20 g，蔗糖10 g，酵母提取物2 g，蛋白胨2 g，K2HPO42 g，KH2PO41.5 g，MgSO41.5 g，蒸馏水1 L，自然pH。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵条件 杂色云芝菌菌丝接种于PDA平面，28℃避光培养7 d。摇瓶装液量100 mL·250 mL-1三角瓶，初始pH6、接种量10%，培养温度28℃，转速200 r·min-1，培养7 d。

1.2.2 响应面分析实验 根据发酵条件单因素实验结果，选择发酵液的初始pH、转速和温度为自变量，生物量和胞外多糖产量为响应值，选择各单因素最优值作为Box-Behnken试验的中心点，根据Box-Behnken实验原理，利用Design-Expert 10.0 软件设计三因素三水平，共17个试验点的中心组合试验，实验设计如表1。

表1 Box-Behnken试验因素和水平

2 结果

2.1 单因素实验

杂色云芝菌菌丝接种于液态基础培养基，摇瓶装液量100 mL·250 mL-1三角瓶，初始pH6、接种量10%，培养温度28℃，转速200 r·min-1，培养7 d。发酵结果表明生物量为9.4 g·L-1，胞外多糖为1.45 g·L-1。

2.2 响应面分析实验

表2 发酵条件的Box-Behnken试验

通过响应面法实验，结果如表2所示，发现初始pH5、接种量8%和温度28℃培育7 d时，生物量和胞外多糖产量最低，分别为生物量5.21 g·L-1和胞外多糖1.2 g·L-1。当初始pH6、接种量10%和温度28℃培育7d时，生物量和胞外多糖均产量最高，分别为生物量10.54 g·L-1和胞外多糖2.11 g·L-1。

利用Design-Expert 10.0软件将实验结果二次回归拟合，进行结果分析。得到生物量回归方程如下：生物量=10.9+0.2×A+0.73×B+0.063×C-0.077×AB+0.023×AC+0.52×BC-2.64×A2-1.86×B2-2.19×C2

表3 生物量回归方程方差分析

注：**极显著；**显著。

由上述所得到的结果，使用软件(Design-Expert 10.0)进行响应面分析，获得了相应的立体图1。图中的各个响应面表示两者的相互作用。可以看出，发酵条件中的初始pH、接种量和温度与云芝发酵产生的生物量存在显著的相关性，其中接种量和初始pH对云芝液态发酵得到的生物量的影响较为显著。在一定范围内，随着接种量和初始pH的提高，云芝发酵所得生物量也会明显增加。等高线图显示圆形则说明交互作用不显著，显示为椭圆形则说明交互作用显著，所以，由图可知初始酸碱度和温度交互作用不显著，接种量和初始酸碱度以及接种量和温度交互作用显著。

表4 胞外多糖回归方程方差分析

注：***极显著；*显著

结果表明(图2)初始pH、接种量和温度与胞外多糖产量存在显著相关性，其中接种量和初始pH对胞外多糖产量影响较为显著。在一定范围内，随着接种量和初始pH的提高，生物量增加。由等高线图看出，初始pH和温度、接种量和温度的等高线图接近圆形，交互作用是不显著的，而接种量和初始pH的等高线图接近椭圆形，交互作用显著。

2.3 最佳发酵条件的验证

根据Box-Behnken设计结果，利用Design-Expert 10.0软件对模型进行预测得到：当初始pH为6.51157、接种量为10.5342%、温度为27.129时，生物量为10.967g·L-1,胞外多糖产量为2.034 g·L-1。为了验证实验结果的可靠性，对上述优化条件进行了验证性实验，实验得生物量10.82 g·L-1，胞外多糖1.98 g·L-1，结果与模型预测值基本一致。

3 结论

通过响应面法优化杂色云芝菌液体发酵条件，得到最佳发酵条件：初始pH6.5、装液量 100 mL·250 mL-1、接种量10%、温度27℃、转速200 r·min-1培养7d。优化后杂色云芝菌液体发酵的胞外多糖为1.98 g·L-1，较优化前胞外多糖提升2.33倍。

4 讨论

前期研究发现杂色云芝菌胞内糖肽对烟草花叶病毒TMV有显著的抑制作用，希望开发一种新的抗病毒剂。因此，需要开展PSP发酵条件的优化，以期获得高产发酵技术。

试验采用的菌株是经过实验室前期鉴定，筛选获得的优良菌株，在此基础上采用单因素筛选、正交设计对发酵培养基进行深入优化，以期得到更高的产量和质量。试验对杂色云芝菌液态发酵条件进行响应面法优化，获得PSP高合成发酵条件，为杂色云芝菌液态发酵产生多糖的工业化提供重要参考。