不同品种烤烟腺毛分泌物及部分有机酸、高级脂肪酸的比较分析

刘晓云, 刘燕, 祖庆学, 廖恒, 冯裕洋, 祖万斌,李碧宽, 陆引罡*

(1.贵州大学农学院, 贵阳 550025; 2.贵州磷化集团贵州开磷质量检测中心, 贵州 开阳 550302;3.贵阳市烟草公司开阳分公司, 贵州 开阳 5503002)

烟草是多腺毛植物，其腺毛数量约占总表皮毛的85%[1]。烟株腺毛在生长发育过程中可分泌一种胶状液体，这种胶状液体被称之为腺毛分泌物。研究表明，烟草表面腺毛分泌物占鲜叶质量的0.5%～10%[2]，腺毛分泌物的数量由腺毛密度和单根腺毛分泌量决定，而腺毛的分泌物主要包括赖百当类和类西柏烷类两类萜化合物[3-4]。这些物质对烟叶的香气、香味以及烟草的抗虫性具有重要的作用[5-7]。类西柏烷类化合物的主要成分是西柏三烯二醇(包括α-西柏三烯二醇和β-西柏三烯二醇)，经过调制后大部分降解，降解代表性产物有茄酮、茄尼呋喃、降茄二酮，其中茄酮在烟叶中存在数量较大，这些物质既有烟草的重要致香成分，也包括烟叶重要的香气前体物质，与烟叶的香味品质密切相关[8]。另外，烟叶中的石油醚浸提物和烟叶香气也有很大关系，研究表明，石油醚浸提物含量与香气量呈正相关[9-11]。因此石油醚浸提物与腺毛分泌物在一定程度上可以衡量烟叶品质的好坏[7-9]。

烟叶中有机酸及高级脂肪酸对烟叶香气质也有一定的影响。烟草中含有大量有机酸，可分为挥发酸、半挥发酸和非挥发酸，占烟叶干物质总量的 12%～16%，占烟叶鲜重的 2.1%～2.4%[12]。非挥发性有机酸包括苹果酸、柠檬酸等，占烟草重量的5%～10%[13]；在烟株体内部分与生物碱结合，部分以游离态存在[12]；其不仅可以调节烟株体内pH，也可以使吃味变得醇和、增加烟气浓度，从而影响烤烟香气[14]。而高级脂肪酸可赋予烟叶特殊的香气，对烟叶的品质等有重要的影响[15-16]，如油酸、亚油酸等高级脂肪酸会增加烟气的刺激性产生涩味。

现有研究表明，同一品种烤烟在不同光照[17]、水分[18]、海拔[19]等条件下，烤烟的腺毛密度、腺毛分泌物、石油醚浸提物及有机酸含量存在一定的差异；同一条件下不同品种烤烟之间也存在一定的差异[20-22]。目前在同一生态环境和栽培条件下，不同烤烟品种腺毛密度、腺毛分泌物、石油醚浸提物、非挥发性有机酸及高级脂肪酸含量变化方面的研究较少。因此，本研究对同一生态环境和栽培条件下的贵州烟区主栽烟草品种的腺毛密度、腺毛分泌物、石油醚浸提物、非挥发性有机酸及高级脂肪酸进行检测，分析不同品种间的差异，探究贵州主栽烟草品种腺毛及其腺毛分泌物的代谢特点，分析腺毛及其腺毛分泌物与部分有机酸、高级脂肪酸之间的相关性，为贵州烟区适宜栽种品种及已有主栽品种的优劣评价提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试烤烟品种为K326、红花大金元、云烟87和云烟97，均由贵州省烟草公司遵义市公司提供。盆栽试验土壤为黄壤土，基础理化性状为：全氮1.39 g·kg-1，碱解氮78.73 g·kg-1，有效磷33.13 g·kg-1，速效钾139.33 g·kg-1，有机质26.20 g·kg-1，pH 5.54。

1.2 试验设计

盆栽试验地点为贵州大学南校区盆栽场。以K326(P1)、红花大金元(P2)、云烟87(P3)、云烟97(P4)4个品种为影响因子，设计单因素盆栽试验，采取随机区组排列，重复3次，分为3个时期取样，共36盆。移栽前1 d每盆施烟草专用基肥(N∶P2O5∶K2O=10∶10∶25)136.6 g，选取健壮、整齐烟苗进行移栽，每盆1株，移栽35 d后再施入烟草专用追肥(N∶P2O5∶K2O=13∶10∶26)41 g，每2～3 d浇水1次(约1 500 mL)。

1.3 样品采集

试验分别对烤烟团棵期、旺长期、成熟期的烟叶进行取样，其中团棵期取整株烤烟叶片，旺长期与成熟期取烟株的第8～16片烟叶，将样品在105 ℃下杀青0.5 h，65 ℃烘干，经磨碎后过1 mm筛，备用。

1.4 测定项目及方法

1.4.1烟草腺毛密度统计 参照蔡璘等[23]方法进行烟草腺毛形态及密度检测。避开叶片主侧脉区域，从上部叶、中部叶、下部叶叶片中部剪下1.5 cm×0.5 cm的长方形，立即放入装有戊二醛的离心管中，4 ℃冷藏24 h，弃去戊二醛，加入磷酸缓冲液洗涤，用30%、50%、70%、90%、100%丁叔醇逐级脱水，4 ℃冷却10 min，-40 ℃冷冻干燥30～40 min，将样品贴于导电胶，镀金膜，完成制片。用SE-3000电子显微镜(日立公司)扫描拍照后，人工计数长柄腺毛和短柄腺毛的数量。

1.4.2石油醚提取物含量测定 参照闫克玉等[24]方法测定烟草中石油醚提取物含量。将烘干粉碎的样品称重记为a，105 ℃烘干3 h，称重并记录重量为b。放入浸提筒，倒入石油醚至接受瓶三分之二处，75 ℃水浴8 h提取。将纸袋取出，在通风处使乙醚挥发。将样品放入烘箱105 ℃烘干2 h，于干燥器中冷却后称重记为c。

石油醚干基=[(b-c)/(b-a)]×100%

1.4.3西柏三烯二醇含量测定 参照赵华新等[25]方法测定西柏三烯二醇含量。具体如下：称取0.4 g烟末于40 mL色谱瓶中，加入0.5 mL内标及10 mL乙腈，超声萃取10 min，加无水硫酸钠。待溶液澄清后，吸1 mL上清液到1.5 mL色谱瓶中，用氮吹仪将溶液吹干后加入0.25 mL DNF和0.25 mL BSTFA，在75 ℃水浴中衍生化反应60 min，取出待测。GC-14B气相色谱仪，PEG-20M弹性石英毛细管柱(25 m×0. 25 mm id×0.25 μm df),载气柱头压140 kPa。进样口温度250 ℃程序升温，40 ℃保持2 min，然后以6 ℃·min-1升温至 180 ℃ 保持 2 min，以2 ℃·min-1升温至 280 ℃ 保持 20 min；载气为高纯氦气，载气流速为恒流 0.8 mL·min-1；进样量 1.0 μL，分流比15∶1；MS 条件为传输线温度 250 ℃，EI 离子源温度280 ℃ ，电离能量70 eV，质 量 数 范 围50～650 amu；检索谱库NIST 11。

1.4.4烤烟有机酸和高级脂肪酸的测定 参照刘百战等[26]方法测定有机酸及高级脂肪酸含量。具体如下：称取0.5 g烟末于干燥三角瓶中,加入25 mL硫酸—甲醇溶液与0.1 mL内标溶液(己二酸-甲醇溶液)摇匀，放置20 h后过滤到装有50 mL蒸馏水的分液漏斗中，用二氯甲烷萃取3次后，加无水硫酸钠干燥，取1.0 μL进行测定。有机酸和脂肪酸标样的制定过程相同，GC-14B气相色谱仪，PEG-20M弹性石英毛细管柱(25 m×0.25 mm id×0.25 μm df),载气柱头压140 kPa。不分流进样,不分流时间为1 min,分流比1∶50。检测器FID,氢气流量40 mL·min-1,空气流量500 mL·min-1,尾吹气流量30 mL·min-1。二阶程序升温,初温60 ℃,保持2 min, 12 ℃·min-1升到120 ℃,再以6 ℃·min-1升到200 ℃,保持5 min，汽化室和检测器温度为250 ℃。

1.5 数据处理

采用Microsoft excel 2003进行数据整理，用DPS 7.05进行统计分析。

2 结果及分析

2.1 不同品种烤烟腺毛密度分析

腺毛按其形态可分为长柄腺毛和短柄腺毛。一般认为，腺毛密度大、发育良好、腺毛分泌物多的烤烟吃味醇和、香气浓郁[27]。由图1可知，各品种烤烟长柄、短柄、总腺毛密度在旺长期最大，随后整体下降，旺长期到成熟期4个品种P1、P2、P3、P4总腺毛密度分别下降9%、12%、6%、11%。说明烤烟腺毛密度到旺长期之后，随着烟叶的成熟腺毛逐渐脱落，云烟87腺毛脱落率较低。

各生长时期烤烟长、短柄腺毛密度存在一定差异。团棵期，P2品种的长柄腺毛密度较P1高7%，P4较P1低8%；旺长期，P2品种的长柄腺毛密度较P1高4%， P3、P4较P1低4%、4%， P3和P4无显著差异；成熟期，P2的长柄腺毛密度较P1高3%，P4较P1低6%。团棵期，P2、P3品种的短柄腺毛密度较P1分别高9%和12%，P4较P1低7%，P2与P3无显著差异；旺长期，P2品种的短柄腺毛密度较P1高7%， P4较P1低16%；成熟期，P2的短柄腺毛密度较P1高5%，P4较P1低9%。综上，长柄腺毛和总腺毛密度整体均表现为红花大金元>K326>云烟87>云烟97。

注：不同英文字母表示同一时期同一指标不同品种间差异在P<0.05水平具有统计学意义，不同希腊字母表示同一指标同一品种在不同生长时期间差异P<0.05水平具有统计学意义。Note: Different English letters of the same index indicate statistically significant difference between different varieties in the same period at P<0.05 level. Different Greek letters of the same index of the same variety indicate statistically significant difference between different growth stages at P<0.05 level.图1 不同品种烤烟腺毛密度Fig.1 Glandular hair density of different varieties of flue-cured tobacco

2.2 不同品种烤烟西柏三烯二醇含量

西柏三烯二醇是烟草腺毛最主要的分泌物，一般认为，西柏三烯二醇含量越高，烟叶香气越醇[28]。由图2可知，α-西柏三烯二醇、β-西柏三烯二醇、(α+β)-西柏三烯二醇含量在旺长期最高，随后呈下降趋势。随着烟叶的发育，烤烟α-西柏三烯二醇、β-西柏三烯二醇和(α+β)-西柏三烯二醇含量在各品种间存在一定差异。团棵期，品种P2、P3、P4的α-西柏三烯二醇含量较P1分别高24%、22%和9%；旺长期，P2、P3的α-西柏三烯二醇含量分别较P1高9%和36%，较P4低7%。团棵期，P2、P3的β-西柏三烯二醇含量分别较P1 高10%和25%；旺长期，P2、P3的β-西柏三烯二醇含量分别较P1高13%、33%，较P4低11%。团棵期，P2、P3、P4的 (α+β)-西柏三烯二醇含量分别较P1高19%、23%和6%；旺长期，P2、P3的 (α+β)-西柏三烯二醇含量分别较P1高11%和35%，较P4低8%。在旺长期以前，随着生育期的增加，各烤烟品种总西柏三烯二醇含量表现为云烟87>红花大金元>K326>云烟97，说明云烟87分泌西柏三烯二醇能力较高。旺长期到成熟期P1、P2、P3、P4西柏三烯二醇含量分别下降36%、54%、69%和39%，说明西柏三烯二醇不稳定，易降解为其他物质，其降解强度表现为云烟87>红花大金元>云烟97>K326。

2.3 不同品种烤烟石油醚提取物含量分析

烟叶石油醚提取物含量常作为评价烟草香味的重要指标之一[29]，烟叶石油醚提取物含量高，品质也相对较高。由图3可知，随着烟株的生长，烟叶石油醚浸提物含量呈逐渐增加趋势。团棵期，品种P2的烟叶石油醚浸提物含量较P1高12%，P3的烟叶石油醚浸提物含量较P1低7%；旺长期，P2的烟叶石油醚浸提物含量较P1高9%，较P4低14%；成熟期，P2的烟叶石油醚浸提物含量较P1高14%，P4低9%。综上，各品种的烟叶石油醚浸提物含量，随着生育期的增加而增加，其中红花大金元显著高于其他3个品种；K326和云烟87两个品种的石油醚提取物含量无显著差异，云烟97石油醚提取物含量最低。

注：不同英文字母表示同一时期同一指标不同品种间差异在P<0.05水平具有统计学意义，不同希腊字母表示同一指标同一品种在不同生长时期间差异P<0.05水平具有统计学意义。Note: Different English letters of the same index indicate statistically significant difference between different varieties in the same period at P<0.05 level. Different Greek letters of the same index of the same variety indicate statistically significant difference between different growth stages at P<0.05 level.图2 不同品种烤烟西柏三烯二醇含量Fig.2 Content of cyprotriene glycol in different varieties of flue-cured tobacco

注：不同英文字母表示同一时期不同品种间差异在P<0.05水平具有统计学意义，不同希腊字母表示同一品种在不同生长时期间差异P<0.05水平具有统计学意义。Note: Different English letters of the same growth stages indicate statistically significant difference between different varieties in at P<0.05 level. Different Greek letters of the same variety indicate statistically significant difference between different growth stages at P<0.05 level.图3 不同品种烤烟各时期石油醚浸提物含量Fig.3 Contents of petroleum ether extracts of different growth stages from different varieties of flue-cured tobacco

2.4 不同品种烤烟部分有机酸及高级脂肪酸含量分析

苹果酸可以增加烟气酸性、改进烟气、使烟气平和，其含量和烟叶的品质呈正相关；柠檬酸的含量则和烟叶品质呈负相关[14]。不同品种烤烟部分有机酸含量结果(图4) 可知，P1、P2、P3、P4的苹果酸、柠檬酸在不同生长时期均存在一定差异。团棵期，P2品种的柠檬酸含量较P1高28%，P3的苹果酸、柠檬酸含量分别较P1高14%、22%，P4的苹果酸含量较P1低13%，而柠檬酸含量较P1高17%；旺长期，P2的苹果酸含量较P1低24%，P4的柠檬酸含量较P1高40%，苹果酸含量低10%；成熟期，P2、P3的柠檬酸含量分别较P1高32%、24%，P4的柠檬酸含量较P1高53%，苹果酸含量较P1低29%。综上，随着生育期的增加，各品种苹果酸含量云烟87相对较高，柠檬酸含量表现为云烟97最高，K326最低，红花大金元和云烟87中等。

不同品种烤烟部分高级脂肪酸含量结果(图4)可知，P1、P2、P3、P4的油酸、亚油酸含量在不同时期存在一定差异。团棵期，P2、P3品种的亚油酸含量分别较P1高25%、28%，P4的油酸含量较P1低15%，亚油酸含量较P1高31%；旺长期，P2的油酸、亚油酸含量分别较P1高57%、85%，P3的油酸、亚油酸含量分别较P1高57%、85%，P4的油酸、亚油酸含量分别较P1高50%、81%；成熟期，P3的油酸、亚油酸含量分别较P1高54%、62%，P4的油酸、亚油酸含量分别较P1高55%、73%。综上，随着生育期的增加，各品种中，云烟87的油酸、亚油酸含量相对较高。

注：不同英文字母表示同一时期同一指标不同品种间差异在P<0.05水平具有统计学意义，不同希腊字母表示同一指标同一品种在不同生长时期间差异P<0.05水平具有统计学意义。Note: Different English letters of the same index indicate statistically significant difference between different varieties in the same period at P<0.05 level. Different Greek letters of the same index of the same variety indicate statistically significant difference between different growth stages at P<0.05 level.图4 不同品种烤烟各时期部分有机酸和高级脂肪酸含量Fig.4 Contents of organic acid and higher fatty acid of different growth stages from different varieties of flue-cured tobacco

2.5 相关性分析

烟叶的品质是各因子综合表现的结果，分析各指标的相关性有利于优良品种的选择。 分别对各时期4个烤烟品种的各项指标进行相关性分析，结果(表1)可知，团棵期，短柄腺毛与β-西柏三烯二醇、苹果酸含量存在显著正相关关系(0.89和0.92)；α-西柏三烯二醇与柠檬酸含量呈显著正相关关系(0.96)，β-西柏三烯二醇与苹果酸含量呈显著正相关关系(0.93)。旺长期，长、短柄腺毛与石油醚提取物含量呈显著和极显著正相关关系(0.91和1.00)，α-西柏三烯二醇与β-西柏三烯二醇呈极显著正相关关系(0.98)，油酸与亚油酸含量呈极显著正相关关系(1.00)。成熟期，长柄腺毛与石油醚提取物呈极显著正相关关系(0.96)，与亚油酸含量呈显著负相关关系(-0.90)；短柄腺毛与苹果酸呈极显著正相关关系(0.99)，柠檬酸含量与短柄腺毛、苹果酸呈显著负相关关系(-0.98和-0.94)，油酸与亚油酸含量呈极显著正相关关系(0.99)。 可以看出，腺毛密度、有机酸、萜类物质、石油醚浸提物、有机酸之间存在密切的关系，其必然存在一定的影响机制。一个品种的优异并不代表它所有的品质化学成分含量都是最优，在实践中需要结合工业可用性、感官品吸、产量、抗病性、特定品种需要来进行选择。

表1 不同烤烟品种各时期各项指标相关性分析Table 1 Correlation analysis of various indexes of different flue-cured tobacco varieties at each stage

3 讨论

烤烟是多腺毛植物，薛晓明等[30]研究黑龙江10个烤烟品种时发现，腺毛密度受环境因素影响较大，烤烟品种的选育可把腺毛密度作为参考指标。蔡璘等[23]也证实了这一观点。本研究表明，腺毛密度随着生育期的增加呈先增加后降低趋势；长柄腺毛、总腺毛密度整体表现为红花大金元>K326>云烟87>云烟97，成熟期云烟87腺毛脱落率最低，这与张亚婕等[27]、李鹏飞等[31]、查宏波等[32]的研究结论相似。而刘晓云等[33]研究发现K326的腺毛密度较红花大金元更高， 原因可能是栽植过程中的不同肥力条件造成。烤烟后期生长肥力供应不足影响烤烟腺毛发育的机理，有待进一步研究。

西柏三烯二醇不仅是烟草腺毛最主要的分泌物，还是烤烟香味的前体物质，其含量越高，烟叶香气越醇[28]。王冬等[34]与Zhu等[35]研究发现不同地区不同烤烟品种分泌西柏三烯二醇含量存在一定差异。本研究显示，在试验区气候条件下，各品种烤烟西柏三烯二醇含量随着时间的增加呈先增加后降低的趋势，与刘翠翠[36]的研究结论相吻合，即不同烤烟品种随着烟株的生长，西柏三烯二醇含量呈先升高后降低趋势。成熟期西柏三烯二醇不稳定，易降解，其降解强度表现为云烟87>红花大金元>云烟97>K326，所以烟叶要适时采收，即使是西柏三烯二醇二醇含量较高的品种云烟87，也会因为过熟而导致西柏三烯二醇迅速降解，甚至低于其它品种。

石油醚提取物包含烟叶的脂肪酸酯、脂肪醇、挥发油、脂肪酸、蜡质、类脂物、菌醇、色素等[37]，殷全玉等[38]发现不同品种烤烟石油醚提取物存在显著差异。本研究表明，随着烟株的生长，各品种烤烟烟叶石油醚浸提物含量逐渐增加，整体表现为红花大金元最高，云烟97次之，K326和云烟87含量中等，这与王勇等[39]研究结果一致。从石油醚提取物与腺毛相关性来看，旺长期和成熟期的石油醚提取物均与长柄、短柄腺毛密度呈正相关，与张思琦等[40]研究结论一致。

烟草苹果酸、柠檬酸是三羧酸循环的中间产物，参与合成蛋白质、氨基酸等物质，成熟期烟叶苹果酸含量与烟叶品质呈正相关，能增加烟叶酸性，而柠檬酸与烟叶品质呈负相关[29]。油酸、亚油酸在一定条件下会分解为己醛、己烯等物质，这些物质会增加烟叶刺激性及粗糙感，从而影响烟叶品质[16,41]。因此，研究不同品种苹果酸、柠檬酸、油酸及亚油酸水平，可以为烟草选育提供理论依据。本研究结果显示，从整体上看，云烟87的苹果酸、油酸、亚油酸含量均较高，而柠檬酸含量随着生育期的增加表现为云烟97最高，K326最低。

综上，在同一生态及栽种条件下，K326、红花大金元、云烟87、云烟97四个品种中，红花大金元的腺毛密度与石油醚浸提物含量均较高；而云烟87的α-西柏三烯二醇、β-西柏三烯二醇、(α+β)-西柏三烯二醇、苹果酸、油酸、亚油酸含量及腺毛脱落率等指标方面表现较优。因此，在贵州地区推荐种植云烟87和红花大金元，但仍需要结合其它因素进行考虑，如品种的抗性、产量等，这有待于进一步研究。