玫瑰红芪当归水煎剂对围绝经期综合征大鼠性激素水平及氧化指标的影响❋

王 静，安方玉，陈雪娟

(1.兰州市第二人民医院，兰州 730000；2.甘肃中医药大学，兰州 730000)

围绝经期妇女因卵巢功能衰退引发性激素和促性腺激素之间的调节紊乱，从而导致机体抗氧化作用减弱，自由基清除功能下降。约2/3的妇女在围绝经期出现以植物神经系统功能紊乱为主的症状，多表现为烦躁易怒、潮热多汗、失眠多梦、心悸、抑郁等[1-3]，严重影响围绝经期妇女的生活质量。如何延缓卵巢衰老，提高围绝经期妇女的生活质量，成为医学界具有重要现实意义的研究课题。本研究通过观察玫瑰红芪当归水煎剂对围绝经期综合征模型大鼠血清雌二醇(estradiol，E2)、卵泡刺激素(follicle -stimulating hormone，FSH)、促黄体生成激素(luteinizing hormone，LH)的含量和子宫组织超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量的影响，探讨其抗氧化机制，从而为其治疗围绝经期综合征提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级Wistar雌性大鼠，体质量180～220 g，由甘肃中医药大学科研实验中心动物饲养室提供，合格证号 SCXK(甘)2011-0007。本实验已通过甘肃中医药大学实验动物伦理委员会审查。

1.2 试剂

大鼠雌二醇(estradiol，E2)ELISA检测试剂盒、大鼠促卵泡素(Follicle- stimulating Hormone，FSH)ELISA检测试剂盒、大鼠促黄体激素(Luteinizing hormone，LH)ELISA检测试剂盒均购自上海源叶生物科技有限公司，批号201708，品牌均为源叶生物；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)试剂盒和丙二醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，批号分别为 20181125、201810905，品牌均为南京建成；戊酸雌二醇片购自拜耳医药保健有限公司广州分公司(规格1 mg/片，批号156 A)。

1.3 仪器

FA2004 N型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；ZY12306型微量加样器(Scien TiFic公司)；TDZ5-WS型医用离心机(湖南平凡科技有限公司)；DNM-9606型酶标分析仪(北京普朗新技术有限公司)；7500型实时荧光定量分析仪(深圳市三利化学品有限公司)；BX53型显微镜(日本OLYMPUS公司)。

1.4 药物

玫瑰红芪当归水煎剂由玫瑰6 g、红芪15 g、当归10 g组成，均购自甘肃中医药大学附属医院，由甘肃中医药大学科研实验中心夏鹏飞老师鉴定。具体换算方法参照参考文献[4]，玫瑰红芪当归水煎剂人用剂量是31 g/d，根据大鼠与人的体表面积换算法得到大鼠的中剂量31×0.018×5≈2.8 g/kg，此剂量属于临床等效剂量，即玫瑰红芪当归水煎剂低、中、高剂量分别为1.4、2.8、5.6 g/kg，分别相当于临床等效剂量 0.5、1、2倍，雌激素戊酸雌二醇片的给药剂量为0.09 mg/kg。

2 方法

2.1 围绝经期综合征大鼠模型的建立

将Wistar雌性大鼠70只随机分为假手术组(15只)和卵巢切除组(55只)，参照文献[5-6]，采用手术切除法切除卵巢切除组大鼠的双侧卵巢。每只大鼠分别以 10% 水合氯醛溶液腹腔注射麻醉后，俯卧位下无菌切开双侧背部并揭开脂肪层，结扎卵巢和子宫的交接处，彻底摘除两侧卵巢，逐层缝合皮肤。假手术组大鼠则同样切开腹腔，揭开脂肪层，将卵巢移出后复位，并不切除卵巢而缝合切口。造模后第7天假手术组和卵巢切除组各取5只大鼠，用ELISA法检测两组大鼠的血清雌二醇(estradiol，E2)含量以判定造模是否成功。实验期间大鼠自由饮水，正常喂食，将实验室温度设置为25 ℃±2℃，湿度设置为65%±5%，每天光照12 h，每周通过称重调节给药量，连续给药6周。

2.2 分组与给药

根据参考文献[7]，于术后第2周根据体质量随机将卵巢切除组的大鼠分为卵巢切除组、玫瑰红芪当归水煎剂低、中、高剂量组(1.4、2.8、5.6 g/kg)和戊酸雌二醇片组(0.09 mg/kg)，另设假手术组每组各10只。各干预组的给药体积均为10 ml/kg，灌胃给药，假手术组和卵巢切除组给予等体积蒸馏水，每天1次，连续6周。

2.3 动物体质量及子宫系数测定

末次给药后，称量各组动物体质量后，腹腔麻醉后股动脉采血处死各组动物，开腹摘取各组动物的双侧子宫，并将子宫周围附着的脂肪组织剥离干净后称重，计算子宫系数：子宫系数(mg/g)=子宫质量(mg)/体质量(g)

2.4 ELISA法检测各组动物血清E2、FSH和LH含量

末次给药后，腹腔麻醉后股动脉采血，室温静置 2 h，2500rpm/min离心15 min，分离血清-80 ℃ 保存，分别用ELISA检测试剂盒，用酶标仪检测各组动物血清E2、FSH和LH的含量，具体操作按试剂盒说明书进行。

2.5 子宫组织的病理学切片检测

将上述每组大鼠的子宫组织切取约200 mg，留作SOD活性和MDA含量检测，剩余的子宫组织每组取6个用4%多聚甲醛固定，将固定好的子宫组织脱水后采用石蜡包埋法制作蜡块，并用切片机切片，切片厚度约5 μm，苏木精-伊红染色、封片。在10×20倍镜下，每张子宫切片随机选取5个视野，观察各组动物子宫组织的子宫管径粗细、子宫内膜厚度、子宫腺体数量、单层柱状上皮细胞的排列等。

2.6 子宫组织SOD活性和MDA含量测定

将上述切取好的子宫组织用手术剪刀迅速剪碎后放入5 ml的塑料试管中，加入1.8 ml的4℃冰生理盐水，用电动匀浆器在冰浴环境下进行匀浆，制备成10%的匀浆液，3000rpm/min离心15 min，吸取上清液，用比色分析法测定各组动物子宫组织SOD的活性和MDA的含量，具体操作按试剂盒说明书进行。

2.7 统计学方法

3 结果

3.1 玫瑰红芪当归水煎剂对围绝经期综合征大鼠体质量及子宫系数的影响

表1示，与假手术组比较，卵巢切除组大鼠的体质量明显升高，子宫系数明显下降(P<0.05)；与卵巢切除组比较，玫瑰红芪当归水煎剂中、高剂量组和戊酸雌二醇片组大鼠体质量明显降低，子宫系数明显增加(P<0.05)。

表1 玫瑰红芪当归水煎剂对围绝经期综合征大鼠体重及子宫系数的影响

3.2 玫瑰红芪当归水煎剂对围绝经期综合征大鼠血清E2、FSH和LH含量的影响

表2示，与假手术组比较，卵巢切除组大鼠的血清E2含量明显降低，FSH和LH含量明显升高(P<0.05)；与卵巢切除组比较，玫瑰红芪当归水煎剂各给药组和戊酸雌二醇片组大鼠血清E2含量明显增加，玫瑰红芪当归水煎剂中、高剂量组和戊酸雌二醇片组FSH和LH含量明显降低(P<0.05)。

表2 玫瑰红芪当归水煎剂对围绝经期综合征大鼠血清E2、FSH和LH含量的影响

3.3 玫瑰红芪当归水煎剂对围绝经期综合征大鼠子宫组织病理形态变化的影响

图1示，假手术组大鼠子宫管径较粗，内膜深厚，腺体丰富，单层柱状上皮细胞排列整齐；卵巢切除组、玫瑰红芪当归水煎剂低、中剂量组大鼠子宫壁明显变薄，管腔狭窄，黏膜层腺体消失，固有层细胞密集，柱状上皮细胞排列紊乱；玫瑰红芪当归水煎剂高剂量组大鼠子宫壁变薄，管腔狭窄，黏膜层出现腺体，单层柱状上皮细胞排列整齐；戊酸雌二醇组大鼠子宫壁变薄，管腔狭窄，单层柱状上皮细胞排列整齐。

图1 玫瑰红芪当归水煎剂对围绝经期综合征大鼠子宫组织病理形态改变比较(HE，×200)

3.4 玫瑰红芪当归水煎剂对围绝经期综合征大鼠子宫组织SOD活性和MDA含量的影响

表3示，与假手术组比较，卵巢切除组大鼠子宫组织的SOD活性明显降低，MDA含量明显升高(P<0.05)；与卵巢切除组比较，玫瑰红芪当归水煎剂中、高剂量组和戊酸雌二醇片组大鼠子宫组织的SOD活性均明显增加，MDA含量明显降低(P<0.05)。

表3 玫瑰红芪当归水煎剂对围绝经期综合征大鼠子宫组织SOD活性和MDA含量影响比较

4 讨论

围绝经期综合征是由于女性卵巢功能逐渐衰退和自身雌激素水平分泌下降而引起机体衰老的一种临床综合征[8]。而机体自由基的蓄积是促成女性衰老的重要因素[8]，其发病机制的根本是神经-内分泌-免疫网络的调节失衡[3]。

自由基堆积引起的卵巢老化是一个较为复杂的生物过程。MDA 是氧自由基引发脂质过氧化作用的一种终产物，SOD 是机体内抗氧化防御系统中唯一能直接清除自由基的酶。为此，MDA的含量变化可以间接反映机体脂质过氧化作用的程度[9]，SOD 的活性大小可作为机体抗衰老能力的一项重要指标。研究已证实[10]，抗氧化酶(SOD、CAT)活性的下降和氧自由基含量的增多会导致动物卵巢黄体溶解及黄体酮生成减少。本实验结果也发现，卵巢切除组大鼠子宫组织SOD活性下降，MDA含量上升，而玫瑰红芪当归水煎剂可以提高围绝经期综合征大鼠子宫组织SOD活性，降低其子宫组织MDA含量，说明玫瑰红芪当归水煎剂可以通过增强机体的抗氧化功能来清除围绝经期综合征大鼠自由基的蓄积，延缓衰老。

现代医学认为，雌激素分泌逐渐减少是妇女发生围绝经期综合症的主要原因。雌激素的分泌减少使其对下丘脑-垂体负反馈抑制作用减弱或消失，致使垂体促性腺激素分泌增加。由腺垂体分泌的FSH 一方面通过促进卵泡细胞的生长发育以利于生殖细胞的成熟，另一方面通过促进新细胞合成 FSH 受体，增强 FSH 对卵泡生长发育的作用，而由腺垂体分泌的LH可使颗粒细胞黄素化并分泌黄体酮[11]。上述激素的分泌变化促使子宫、阴道、乳腺等生殖器官出现萎缩，而脏器系数下降是判定器官萎缩、退行性变的标准之一[3]。也有研究发现，围绝经期综合征患者发生潮热前，LH 经垂体脉冲样释放，LH 水平越高说明患者症状越严重[12]。本实验结果发现，卵巢切除组大鼠子宫系数明显降低，血清中E2含量显著降低，FSH、LH含量明显升高。这一结果说明机体去卵巢后，E2水平下降是引起下丘脑-垂体-卵巢轴功能衰退的根本原因。当给予玫瑰红芪当归水煎剂后，子宫系数明显升高；血清中E2含量显著升高，FSH、LH含量明显降低。进一步推测其作用机制可能是通过调节去卵巢模型大鼠的性激素水平，增加雌激素生物效应，改善下丘脑-垂体-卵巢轴功能，从而延缓生殖器官退行性变化。

因此，玫瑰红芪当归水煎剂可能通过增强机体抗氧化功能来减轻围绝经期综合征大鼠的氧化应激损伤，同时通过增加机体的雌激素生物效应来改善下丘脑-垂体-卵巢轴功能，从而发挥延缓生殖器官退行性变的作用，其具体分子生物学机制尚需今后进一步研究。