微乳色谱法同时测定化妆水中9种防腐剂*

陈燕君，张泽鸿，谢晓琪，罗纯娜，彭 程，周 欣

(广东药科大学药学院，广东 广州 510006)

近年来，我国化妆品总体消费水平已超欧盟、日本，仅次于美国，成为世界上化妆品消费第二大国。随着人们消费能力的增强，人们也越来越关注化妆品的使用安全，赵康峰等[1]对8大类化妆品进行急性皮肤刺激性试验，结果表明各类受试化妆品均出现不同程度的急性皮肤刺激性损害效应。这主要是因为化妆品在生产、使用和保存过程中多种因素都可造成微生物污染，防止化妆品二次污染主要靠添加防腐剂[2-5]，但防腐剂种类繁多且均具一定毒性，过量频繁接触会导致人体过敏反应，大多数防腐剂对人皮肤会产生不同程度的刺激[6-9]。因此，监控化妆品中防腐剂的种类和含量尤为重要，我国《化妆品安全技术规范》2015年版规定了51种准用防腐剂的使用限量[10]。

实验中选取了使用较为广泛的化妆水进行检测，目前化妆水中防腐剂测定方法有高效液相色谱法[11-15]、气相色谱法[16-17]、气质法[18]、液质法[19]、胶束电动色谱法和毛细管电泳法[20-21]等，以高效液相色谱法为主，但这些方法流动相复杂，样品保留时间长，所以需要一种简单、快速、稳定、环保的测定方法，微乳色谱的出现正好可以解决这些问题。

微乳液相色谱(Microemulsion Liquid Chromatography，MELC)法，是由水、油、表面活性剂和助表面活性剂按适当比例混合，自发形成的各向同性、透明或半透明、低粘度、热力学稳定的分散体系[22]。最常用的水包油型微乳是以十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)做表面活性剂，烷烃(庚烷、辛烷等)为油相，短链醇(丁醇、戊醇等)做助表面活性剂和一定量的水或缓冲液组成的体系。与常规高效液相不同，微乳中的表面活性剂与固定相表面吸附，使溶质在修饰后的固定相、微乳液滴、水相之间进行分配转移达到平衡，改变组分在高效液相中两相间的分配特性。因此，本研究建立同时测定化妆水中常用防腐剂的微乳色谱法，以期为化妆水中防腐剂的快速检测提供技术支持。

1 实 验

1.1 试剂与仪器

十二烷基硫酸钠(SDS，w=99.5%，生物技术级)，上海麦克林生化科技有限公司；对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯(w>99.5%)，迪马公司；甲基异噻唑啉酮、苯氧乙醇、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、山梨酸钾(w>99.5%)，麦克林公司；氯苯甘醚(w>99.5%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇、正丁醇、正辛烷、磷酸均为分析纯，广州化学试剂厂；水为屈臣氏蒸馏水；检测样品为市售化妆品，样品信息见表1。

表1 化妆水样品信息

高效液相色谱仪1260系列，G1311A系列四元泵，G1314A系列DAD检测器，Chem32工作站，安捷伦科技公司；KQ-250DE超声波清洗器(频率(35±5) kHz，功率250 W)，昆山市超声仪器有限公司；Anke TDL80-2B离心机，上海安亭科学仪器厂；TX223L电子天平，SHIMADZU。

1.2 色谱条件

色谱柱:Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温30 ℃，检测波长254 nm，流量0.7 mL/min，进样体积20 μL；流动相3.0%(W/V)十二烷基硫酸钠SDS-6.0%(V/V)正丁醇-0.4%(V/V)正辛烷-90.6%(V/V)0.1%磷酸水。

1.3 标准储备液的配制

分别精密称取甲基异噻唑啉酮、苯氧乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、山梨酸钾、氯苯甘醚、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、对羟基苯甲酸丁酯403 mg、245.5 mg、25.5 mg、129.5 mg、103.2 mg、4.5 mg、10.5 mg、499.92 mg、10.6 mg于10 mL、50 mL、25 mL、100 mL、25 mL、100 mL、50 mL、10 mL、50 mL容量瓶，用甲醇溶解定容至刻度，摇匀，经0.22 μm滤膜过滤，得质量浓度分别为40.3 mg/mL、4.91 mg/mL、1.02 mg/mL、1.30 mg/mL、4.13 mg/mL、0.045 mg/mL、0.21 mg/mL、50.0 mg/mL、0.21 mg/mL的标准储备液。

1.4 样品预处理

取样品1 g，精密称定，置于25 mL具塞三角瓶，精密加入甲醇10 mL，称重，振摇，超声提取30 min，补足失重，经0.22 μm滤膜过滤，取续滤液为供试溶液。

2 结果与讨论

2.1 专属性

空白、混合标准溶液、样品色谱图如图1～图3所示，9种防腐剂保留时间分别为3.386 min，7.788 min，8.583 min，9.439 min，10.340 min，11.421 min，14.776 min，16.356 min，17.929 min。在选定色谱条件下，化妆水样品G17中无杂质干扰测定。

图1 空白样品色谱图

图2 9种防腐剂混合标准溶液色谱图

图3 样品(G17)色谱图

2.2 提取溶剂

考察水、甲醇及两种溶液混合后作提取溶剂，结果表明9种防腐剂在甲醇中提取效果最好，经甲醇提取后滤液澄清且稳定性高，目标防腐剂峰面积大且杂质峰少；用水或混合液提取后样品不稳定且滤液浑浊。故以甲醇为提取溶剂。

2.3 提取方法

实验考察超声30 min、2500 r/min离心15 min、超声30 min后以2500 r/min离心15 min三种提取方法，第二种方法提取后溶液浑浊，第一、三种方法提取后溶液澄清，但第三种方法提取后溶液底部有絮状沉淀，最终采取超声30 min作为样品提取方法。

2.4 微乳色谱优化

2.4.1 表面活性剂

表面活性剂指加入少量能使其溶液体系界面状态发生明显变化的物质，通过降低溶液表面张力构成界面膜，形成稳定的微乳。目前微乳最常用的表面活性剂为十二烷基硫酸钠(SDS)，一种无毒的阴离子表面活性剂，可作乳化剂，其生物降解度大于90%，降解速度快，是环保性能较好的表面活性剂。实验用SDS作表面活性剂。

2.4.2 助表面活性剂

助表面活性剂主要影响体系的热力学性质，起协助表面活性剂降低界面张力、增加界面流动性、增加微乳的膜强度及减少微乳形成时的界面弯曲，使微乳自发形成并稳定存在的作用。实验考察异丙醇和正丁醇对分离的影响。以异丙醇为助表面活性剂时，色谱峰出现拖尾及分叉。支链的异丙醇对微乳形成无明显的促进作用，可能因支链增加导致醇空间位阻增大，使其插入界面膜的阻力增大[23]。故以正丁醇为助表面活性剂。

2.4.3 油 相

在微乳色谱中，油相的加入增加了流动相中有机相比例，缩短保留时间；另一方面，油相分子分配到固定相上，使固定相的极性变小，使化合物的保留和选择性变化更复杂[24]。实验考察环己烷、正庚烷和正辛烷对分离选择性的影响，以环己烷为油相时出现色谱峰分叉，环己烷增溶及洗脱能力均较弱，与溶剂的洗脱能力差异较大，易出现色谱峰分叉；以正庚烷为油相时，分离度好，但出现前沿峰，可能是流动相局部洗脱能力增强，样品未被流动相充分稀释，也有色谱峰分叉，且保留时间变长。故选择正辛烷为油相。

2.4.4 流动相配制顺序

实验对比以表面活性剂-水相-助表面活性剂-油相以及表面活性剂-助表面活性剂-水相-油相为顺序配制流动相，发现前者色谱峰保留时间变短，且流动相更稳定，在色谱柱中更易达到平衡，实验中以此顺序配制流动相。

2.4.5 流动相比例考察

实验考察时通过调节SDS与水的比例，来确定SDS的范围；采用稀释法考察将SDS比例调低对分离的影响，即先按照3.0%SDS(W/V)-6.6%正丁醇(V/V)-0.8%正辛烷(V/V)-89.6%水(V/V)配制原溶液，量取一定量配制好的原溶液后，再加水使成400 mL。原溶液：水的比例为390:10、380:20、370:30比例下，苯氧乙醇峰形不佳，对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯色谱峰均拖尾，360:40比例下，以上四种防腐剂仍拖尾；350:50比例下，以上四种防腐剂基本分离，但其他组分不分离。实验又考察固定正丁醇(6.6%，V/V)、正辛烷(0.8%，V/V)的比例，对比SDS(W/V)为3.0%、3.5%、4.0%时的色谱图，发现比例为3.5%、4.0%时，保留时间较3.0%的均延后，4.0%的延后更明显，且样品均不能很好分离。最终确定流动相的比例为3.0%(W/V)十二烷基硫酸钠(SDS)-6.0%(V/V)正丁醇-0.4%(V/V)正辛烷-90.6%(V/V)(0.1%磷酸)水。

2.5 方法学验证

2.5.1 标准曲线

分别吸取一定量的9种防腐剂对照品贮备液，加甲醇稀释成不同浓度梯度的混合标准溶液，依次进样，以相应的质量浓度为横坐标，组分的峰面积为纵坐标绘制标准曲线，线性回归方程和相关系数见表2，9种防腐剂在0.945～4999.2 μg/mL浓度范围内呈现良好的线性关系且相关系数均大于或等于0.9996，可用于定量分析。

表2 9种防腐剂的线性范围、回归方程和相关系数

2.5.2 精密度实验

取混合标准溶液的对照品溶液(甲基异噻唑啉酮、苯氧乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、山梨酸钾、氯苯甘醚、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯和对羟基苯甲酸丁酯的质量浓度分别为2015 μg/mL、245.5 μg/mL、25.5 μg/mL、9.065 μg/mL、206.4 μg/mL、6.75 μg/mL、10.5 μg/mL、2499.6 μg/mL、10.6 μg/mL)进样20 μL，连续测定6次，记录峰面积，计算得RSD均小于1.88%，表明该方法精密度良好。

2.5.3 重复性实验

取化妆水G17样品 6份，每份1 g，按“2.5.2”项下方法处理，依次进样20 μL，样品所含防腐剂的峰面积RSD皆小于1.99%(n=6)，表明该分析方法重复性良好。

2.5.4 稳定性实验

取化妆水样品G17 1 g，按“2.5.2”项下方法处理，在0、2、4、6、8、10、12 h，分别进样20 μL，记录峰面积。结果样品中所含防腐剂的RSD 皆小于0.97%，表明该化妆水样品溶液在12 h内稳定。

2.5.5 加样回收率

精密称取化妆水样品G17 0.5 g共9份，分别加入相应量的低(80%)、中(100%)、高(120%)浓度的9种防腐剂对照品，每个质量浓度水平平行制备3份，按“2.5.2”项下方法处理，依次进样20 μL，计算回收率，平均回收率为95.1%～104.6%，RSD为0.57%～5.30%，说明样品回收率良好。

表3 样品加样回收结果

2.6 样品测定

实验前以调查问卷形式收集化妆水使用情况，测定使用人数较多的具一定代表性的29份市售化妆水样品(其中6份为化妆水配套的乳液)。结果显示，有9份化妆水同时含2种防腐剂，有7份化妆水同时含3种防腐剂；化妆水和其配套的乳液中添加的防腐剂并不完全一样；部分化妆水成分表与本实验实际检出结果不一致。

根据实验检出结果，9种防腐剂在29份化妆水中的检出率见图4，其中标示率是按29份化妆水标签成分表中含有的防腐剂计算所得。有13份化妆水样品成分表中未标示含对羟基苯甲酸甲酯但却检出含有该防腐剂；已标示有对羟基苯甲酸乙酯的样品全部检出，但还有7份样品未标示仍检出该防腐剂；另外，9种防腐剂中，苯氧乙醇和对羟基苯甲酸甲酯都是检出率较高的防腐剂成分，这两种防腐剂也是化妆水中添加较为普遍的两种成分，作为比较温和的苯氧乙醇防腐体系，其检出率和标示率相对比较接近，但是刺激度较高的对羟基苯甲酸甲酯，其检出率却是标示率的2倍，说明化妆水使用过程中造成过敏、炎症等情况有可能是因为成分表中未准确标出全部的防腐剂造成，因此也提示消费者在购买化妆水时不能完全依赖成分表上的标示。

图4 9种防腐剂检出结果

3 结 论

近年来，化妆品中新型防腐剂发展迅速，使用频率不断增加[25]，本实验中部分化妆水成分表标示的防腐剂与检出结果不一致，对化妆水的监督检验与质量控制需引起重视，以保障人们使用的安全性。

本研究建立了同时测定化妆水中9种防腐剂的微乳色谱法并进行了系统研究，弥补了常规高效液相色谱法出峰时间较长的缺点[26-27]，分离效率高且速度快，前处理简单，有机溶剂用量少，成本低，毒性低，环境污染小，更为绿色环保，可满足市售化妆水中防腐剂的定性和定量分析要求。