大通牦牛DQA2基因CDS区序列分析

（西北民族大学生命科学与工程学院， 兰州 730030）

主要组织相容性复合物（MHC）含有高度多态性基因，编码受体参与免疫反应，其Ⅱ类区域编码两种同种型DR和DQ的抗原呈递分子，这些高度多态性的细胞表面糖蛋白主要结合来自外源抗原的肽片段，并将它们呈递给CD4+T细胞以引发免疫应答[1]。DQA基因定位于BTA23 q21[2]，且具有高度多态性[3]。研究表明，每个MHC等位基因对一类潜在抗原有反应，具有更多不同MHC位点的个体和群体能够更好地应对多种感染[4]。同时，来自哺乳动物的DQA多态性信息可用于遗传改良计划。

近几年来，已有大量对于哺乳动物DQA基因多态性的研究结果，Koutsogiannouli等[5]对棕色野兔中的DQA基因座进行分析，结果显示674个样本出现了37个等位基因。Plasil等[6]对三种骆驼科动物样本的DQA外显子2进行多态性分析发现了三个等位基因。Goda等[7]为了研究棕熊（Ursus arctos）种群中DQA基因的遗传多样性，在32只棕熊确定了DQA的四个等位基因。Archie等[8]发现30头非洲大象中存在DQA基因的6个等位基因，3只亚洲象中存在DQA的4个等位基因。Koutsogiannouli等[9]使用SSCP方法结合测序研究了四种地中海家羊（Ovis aries）的DQA2基因，总共检测到46个DQA2等位基因。Gonge等[10]对印度大额牛进行研究发现，在大额牛中存在三个DQA等位基因。这些研究结果均证明了DQA基因具有高度多态性。

大通牦牛由于其遗传性能稳定、产肉性能较好、生活力强、抗逆性优良且能适应高山高寒的草场，深受牦牛饲养地区的欢迎，这对于建立我国牦牛制种和供种体系，改良我国牦牛品种，提高牦牛生产力及牦牛业整体效益乃至当地畜牧业整体效益具有重要的经济意义。本研究通过测定大通牦牛DQA2基因序列再拼接得到CDS区（Coding sequence）序列，利用生物信息学方法，对大通牦牛DQA2基因CDS区序列编码的蛋白质理化性质、疏水性/亲水性、N-糖基化位点、信号肽预测和蛋白质跨膜结构、二级结构和三级结构等进行分析，以期为大通牦牛DQA2基因结构与功能研究提供参考以及为其抗病育种提供理论基础。

表1 BoLA-DQA2基因引物信息表

1 材料与方法

1．1 试验材料

从宁夏农垦贺兰山奶业有限公司采集中国大通牦牛尾静脉血液各10mL，低温保存，带回实验室后-20℃冷冻保存。采用传统的酚-氯仿抽提法提取血液基因组DNA，提取的DNA用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1．2 引物设计

根据GenBank数据库中牛的DQA2基因序列（登录号：XM_024983852.1），利用NCBI在线软件Primer-BLAST反向互补设计BoLA-DQA基因4对引物（表1），分别扩增四个外显子序列和部分内含子序列，引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

1．3 基因组DNA混合池的构建和PCR扩增

随机选取55头大通牦牛DNA样品，每50个样品构建一个DNA混合池，以混合池DNA为模板进行扩增。扩增体系为：PCR反应总体积20µL，其中混合DNA1µL，2×Power Taq PCR MasterMix（百泰克）11µL，上下游引物（10µmol/L）各0.4µL，灭菌超纯水7.6µL。扩增条件为：94℃预变性 5min；94℃变性 30s，退火（退火温度见表1）30s，72℃延伸30s，从第二步开始进行30个循环；最后72℃延伸10min；4℃保存。扩增产物利用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1．4 序列测定与分析

选取扩增效果良好的DQA2基因4个外显子PCR扩增产物送至苏州金唯智生物科技有限公司进行双向测序，测序结果用MEGA6.0和Editseq软件进行比对，获得DQA2基因CDS区序列。

1．5 生物信息学分析

对BoLA-DQA2基因进行生物信息学分析，所用到的网站及软件见表2。

表2 BoLA-DQA2基因生物信息学分析方法

2 结果与分析

2．1 大通牦牛DQA2基因编码蛋白质理化特性预测与分析

表3 大通牦牛 DQA2基因编码蛋白质理化特性

蛋白质的基本性质包括相对分子质量、氨基酸组成和等电点等，利用Expasy服务器上的protparam程序预测大通牦牛DQA2基因编码蛋白质理化特性（表3）。大通牦牛DQA2基因编码253个氨基酸，20种氨基酸所占比例见图1，可以看出亮氨酸（Leu）最多，占整个氨基酸组成的10.3%，色氨酸（Trp）最少，占1.2%。基因编码产物不稳定指数大于40，表明该基因编码产物不稳定[11]。

图1 大通牦牛DQA2基因编码蛋白质氨基酸组成

2．2 大通牦牛 DQA2基因编码蛋白质疏水性/亲水性预测和分析

运用Expasy服务器上的Protscale程序预测大通牦牛DQA基因编码蛋白质的疏/亲水性，结果（图2）显示该蛋白质第234位苏氨酸（Thr）疏水性最强(+3.122) ，第51位的谷氨酸（Glu）和第52位的苯丙氨酸（Phe）亲水性最强（－1.900）。整个编码产物中，亲水氨基酸占55.28%，疏水氨基酸占45.72%，平均分值为-0.021，表现为亲水性，由此可推断大通牦牛DQA2基因编码的蛋白质是一种可溶性蛋白质。

图2 大通牦牛DQA2基因编码蛋白质的疏水性/亲水性预测

2．3 大通牦牛 DQA2基因编码蛋白质 N-糖基化位点的预测和分析

蛋白质糖基化是指在蛋白质合成的同时或合成后，在酶的催化下寡糖链被连接在特定的糖基化位点，形成糖蛋白。利用CBS在线分析软件Net NGlyc 1.0对DQA的N-糖基化位点进行预测得出(图3)，大通牦牛DQA2基因编码蛋白质具有4个潜在的N-糖基化位点，分别为Asn31、Asn96、Asn260、Asn369。

图3 大通牦牛 DQA2基因编码蛋白质 N-糖基化位点预测

2．4 大通牦牛DQA2基因编码蛋白质信号肽分析

信号肽位于蛋白质N端，一般由16～26个氨基酸残基组成[12]。大通牦牛 DQA基因编码蛋白质信号肽分析结果（图4）显示，DQA2基因编码蛋白质的分值曲线较为典型，其中C值和Y值趋向于+1，S值在剪切位点之前较高而在剪切位点之后变低。大通牦牛DQA基因在第1～23位氨基酸之间存在信号肽，其切割点位于23～24位的氨基酸之间（信号肽剪切点主要根据Y最大值大于0.5来判断）。

图4 大通牦牛DQA2基因编码蛋白质信号肽分析

2．5 大通牦牛DQA2基因编码蛋白质跨膜结构域分析

利用TMHMM程序分析其跨膜结构域，从结果（图5）可以看出，DQA2编码的蛋白质共存在1个典型的跨膜螺旋区，氨基酸序号为216-239。由此可推测，大通牦牛DQA2基因CDS区所编码的蛋白质为跨膜蛋白。

图5 大通牦牛DQA2基因编码蛋白质的跨膜区域预测结果

2．6 大通牦牛DQA2基因编码蛋白质二级结构和三级结构预测与分析

蛋白质的二级结构是指多肽链主链折叠产生的由主链内和主链间周期性氢键维系的有规则构象，这些构象借助各种次级键共同构成其三级结构。大通牦牛DQA基因编码蛋白质二级结构预测结果（图6）显示，二级结构组分中α-螺旋（Hh）占13.44%，β-折叠（Ee）占31.62%，无规则卷曲（Cc）占54.94%。其中Hh＜45%，Ee＞20%，因此判断大通牦牛DQA基因编码蛋白质二级结构为混合型[13]。其三级结构见图7。该蛋白质存在较多的无规则卷曲，结构较为复杂，该结果同时也表明了大通牦牛DQA2编码的蛋白质由α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲组成，与二级结构预测结果一致。

图6 大通牦牛 DQA 基因编码蛋白质二级结构预测

图7 大通牦牛DQA2基因编码蛋白质三级结构预测

2．7 大通牦牛DQA2基因编码蛋白质功能预测

表4 DQA2基因编码的蛋白质功能分析

通过蛋白功能预测分析，DQA2基因编码的蛋白质主要功能包括：信号受体活性、催化活性、运载体、调节代谢过程、细胞定位及免疫系统过程等（表4），由此推断DQA2基因编码的蛋白质有细胞间信号转导、调节细胞代谢及参与免疫系统过程的功能。

3 讨论

在哺乳动物中，DQA2基因属于有高度多态性的基因组，对DQA2基因进行生物信息学分析有助于对动物种群资源保护、物种的多样性等方面进行探讨[14]。DQA2基因与牛乳房炎的抗性和易感性有关[15]，通过对其生物信息学分析产生的结果对实际生产有一些帮助。

在DQA2基因编码的19种氨基酸中，有26个营养价值最高的亮氨酸（Leu），而对蛋白质空间结构发挥重要作用的半胱氨酸（Cys）为4个，说明大通牦牛DQA2基因编码蛋白质中的半胱氨酸高度保守。许多膜整合蛋白质是兼性分子，它们的多肽链可横穿膜一次或多次，以疏水区跨越脂双层的疏水区，与脂肪酸链共价结合，而亲水的极性部分位于膜的内外表面。这种蛋白质跨越脂双层，被称为跨膜蛋白，主要分单个跨膜的α-螺旋、多个α-螺旋和β-螺旋3种特殊的结构类型，其在细胞信号传导过程中发挥着物质运输、信息识别、保护等作用[16]。跨膜蛋白的标志是在多肽链中出现多个亲水区与疏水区间隔的现象[17]，由于跨膜蛋白存在着等同受体的作用，对于大通牦牛DQA2基因编码蛋白质疏水性/亲水性预测和分析，有利于理解其性质与功能。本研究中发现DQA2基因编码的蛋白中亲水性氨基酸占比超过50%，推测为可溶性蛋白。通过TMHMM软件在线预测，发现该蛋白存在明显的跨膜螺旋区，为跨膜蛋白。

蛋白质的糖基化是最重要的翻译后修饰之一，与蛋白质结构和功能的关系密切。蛋白质糖基化修饰能够影响多肽的构象，使多肽链具有一定刚性，达到增强蛋白质稳定性的作用，进而调控在组织和细胞中的定位、功能和活性[18]，糖基化位点发生变化可能与疾病的发生有关[19]。大通牦牛DQA2基因编码蛋白质具有4个潜在的N-糖基化位点，分别为 Asn31、Asn96、Asn260、Asn369。

同源建模是一种根据蛋白结构保守稳定性远大于蛋白氨基酸序列的理论预测蛋白质三维结构的方法，如果氨基酸序列相似性达30%以上，则可用已知蛋白结构作为模板模拟蛋白质三维结构[20,21]。信号肽是蛋白多肽链中用于指导蛋白质跨膜转移(定位)的N-末端的氨基酸序列，一般由15～30个氨基酸组成，蛋白成熟后信号肽将被剪切掉。本研究中大通牦牛DQA基因在第1～23位氨基酸之间存在信号肽，其切割点位于23～24位的氨基酸之间。功能分析发现，DQA2基因编码的蛋白质可与受体结合，参与免疫系统过程，推测其与物种的抗病性相关，不过这还有待进一步研究。并且其有催化活性和运载体的功能，说明其参与细胞间信号和物质的传递，这与蛋白结构域和跨膜结构预测结果相一致。

本研究通过生物信息学和基因组学得出的大通牦牛DQA2基因功能和结构，可以为今后更好地研究大通牦牛的抗病育种提供重要的理论依据。